通过葡萄糖 / 木糖共利用的模块化途径工程增强大肠杆菌中对氨基苯甲酸（pABA）和 4 - 氨基苯丙氨酸（4APhe）的生产

推荐阅读：本文利用模块化代谢工程策略，以葡萄糖和木糖为共底物，在大肠杆菌中实现对氨基苯甲酸（pABA）和 4 - 氨基苯丙氨酸（4APhe）的高效合成。通过优化底物浓度、消除碳泄漏等手段提高产量，为微生物生产化学品提供新思路，值得关注。

　　### 引言
对氨基苯甲酸（pABA）用途广泛，在树脂、染料、制药等行业都有重要应用，其生物合成有望成为生产聚对苯二甲酸乙二酯（PET）和对苯二胺的可持续替代途径。代谢工程和合成生物学的发展为构建微生物细胞工厂提供了多种工具和策略，已有研究通过改造微生物菌株提高了 pABA 产量，但微生物工程面临代谢负担的挑战。模块化代谢工程可优化工程菌株，此前研究已通过重组大肠杆菌代谢途径提高了生产效率。本研究尝试利用葡萄糖和木糖共利用的方式增强 pABA 生产，并探索该策略对 4 - 氨基苯丙氨酸（4APhe）生物合成的潜力。

材料和方法

1. 菌株和质粒：以大肠杆菌（E. coli）ATCC31882 为宿主菌株，NovaBlue 用于基因克隆。使用多种质粒和引物进行基因操作，通过 CRISPR - Cas9 系统进行基因敲除。
2. 培养基：使用多种培养基，如 LB 培养基、M9Y 培养基及其改良版本等，根据不同实验目的和菌株需求添加相应成分及抗生素。
3. 培养条件：摇瓶培养和生物反应器培养条件不同，摇瓶培养在特定转速和温度下进行，生物反应器培养需控制温度、pH、溶解氧（DO）等参数，并根据菌株调整补料策略。
4. 分析方法：通过测量 OD₆₀₀监测细胞生长，利用高效液相色谱（HPLC）分析糖类、pABA 和 4APhe 含量。

结果与讨论

1. 构建以葡萄糖和木糖为共底物的 pABA 生产菌株：以E. coli GX1 为宿主菌株，该菌株适用于合成莽草酸途径衍生物。pABA 可通过莽草酸途径合成，本研究使用含有pabABC基因的 pZE12 - pabABC质粒生产 pABA。当以葡萄糖为唯一碳源时，菌株生长不佳且 pABA 产量低。引入 Dahms 途径后构建的 GX1BD 菌株，pABA 产量有所提高但仍不理想。引入 Weimberg 途径构建的 GX1BW 菌株，pABA 产量显著提高，达到 1.27 ± 0.07 g/L，且细胞生长和底物消耗情况改善。
2. 敲除基因提高 L - 谷氨酰胺（L - Gln）可用性：研究发现补充 L - Gln 可促进 GX1BW 菌株生长和提高 pABA 产量。敲除与 L - Gln 消耗相关的基因，构建多个菌株进行实验，结果表明组合敲除这些基因并不能提高从葡萄糖生产 pABA 的效价，说明提高 L - Gln 利用效率对增加 pABA 产量效果不佳。
3. 优化葡萄糖 / 木糖比例和消除碳泄漏控制 pABA 生产：改变葡萄糖和木糖比例培养 GX1BW 菌株，发现高初始木糖浓度使木糖吸收更快，但对 pABA 生产、细胞生长和葡萄糖摄取影响不显著。敲除丝氨酸脱氨酶（LSD）相关基因和木糖异构酶途径基因构建 GX16BW 菌株，该菌株 pABA 产量提高，葡萄糖和木糖消耗增加，表明调节木糖消耗可控制 pABA 生产。
4. 葡萄糖 / 木糖共底物补料分批培养生产 pABA：对 GX16BW 菌株进行补料分批发酵，发现后期 pABA 产量停止增加且 4 - 乙酰氨基苯甲酸积累。敲除nhoA基因构建 GX17BW 菌株，仍有 4 - 乙酰氨基苯甲酸积累。在葡萄糖和 MgSO₄丰富的培养基中培养 GX17BW 菌株，pABA 产量提高到 8.22 g/L，4 - 乙酰氨基苯甲酸积累减少，表明 MgSO₄可能影响 pABA 乙酰化，进一步研究其机制有助于提高 pABA 产量。
5. 途径工程菌株生产 4APhe：选择 4APhe 作为目标化合物，其合成途径与 pABA 部分相同，但不释放丙酮酸（PYR）。构建 4APhe 生产菌株 GX16AW，在不同葡萄糖和木糖浓度培养基中培养，48 h 后在高葡萄糖培养基中产量为 2.48 ± 0.39 g/L。补料分批发酵可提高 4APhe 产量，达到 4.90 g/L，但在 MgSO₄丰富培养基中培养未显著提高产量，说明 4APhe 生物合成途径需进一步优化。

结论

本研究表明，将代谢途径分为生产和能量模块的共利用策略可有效提高大肠杆菌中 pABA 和 4APhe 的产量。优化初始糖浓度和消除碳泄漏途径使 pABA 产量大幅提高，达到 8.22 g/L，这是目前工程化大肠杆菌生产 pABA 的最高水平。虽然 4APhe 生物合成途径不释放 PYR，但也实现了较高产量。该研究为微生物生产化学品的共利用策略提供了有价值的见解，不过底物比例对产量的影响有待进一步研究。