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本文开发了蛙病毒 3（FV3）的反向遗传学系统，利用转化相关重组（TAR）克隆构建了可在酵母和细菌中操作的合成克隆，并建立了新的病毒拯救方法。该系统有助于研究虹彩病毒生物学，还能作为开发鱼类和两栖类改良活疫苗的平台。
### 引言
虹彩病毒（Iridoviruses）是一类大型双链 DNA 病毒，属于核质大 DNA 病毒门（Nucleocytoviricota），在细胞核和细胞质中都能复制。其分为两个亚科七个属，α 虹彩病毒亚科（Alphairidovirinae）感染变温脊椎动物，β 虹彩病毒亚科（Betairidovirinae）主要感染无脊椎动物。其中，蛙病毒属（Ranavirus）对生态和经济影响显著，是两栖动物大规模死亡的主要原因之一，导致两栖动物种群数量急剧下降。
然而，由于缺乏反向遗传学系统，虹彩病毒的生物学研究受到很大限制。目前还没有针对整个 Megaviricetes 纲的反向遗传学系统，研究人员只能依靠传统的同源重组方法在感染细胞中生成重组病毒，这种方法耗时耗力。本研究旨在开发蛙病毒 3（FV3，Ranavirus rana1）的反向遗传学系统，以推动虹彩病毒研究。
FV3 是研究最广泛的虹彩病毒之一，本研究的反向遗传学系统基于细菌人工染色体 - 酵母人工染色体（BAC - YAC），通过酵母中的转化相关重组（TAR）克隆技术构建。TAR 克隆利用酵母高效的同源重组能力，可选择性地分离和克隆大型 DNA 分子，病毒基因组可通过重叠片段组装或一步法克隆。
此外，虹彩病毒不能从转染到允许细胞的完整全长病毒 DNA 中拯救出来，这是一个技术难题。虽然可以用紫外线照射的同源辅助病毒从裸露 DNA 中拯救虹彩病毒，但本研究提出了一种使用复制型异源辅助病毒的替代拯救方法，以减少克隆病毒和紫外线照射病毒基因组之间同源重组的可能性。
结果
- 建立虹彩病毒反向遗传学系统：为构建 FV3 的全长感染性克隆，研究人员将 FV3 基因组分为 14 个大小约 8kb 的重叠片段，用高保真聚合酶扩增，再与线性 BAC - YAC 载体在酵母 Saccharomyces cerevisiae VL6 - 48N 中通过 TAR 克隆组装。从数百个菌落中随机挑选 10 个酵母菌落，将其 DNA 转化到大肠杆菌中，经限制性片段长度多态性（RFLP）分析筛选出 3 个含有完整 FV3 基因组的克隆（S3A、R1A 和 R2A）。
对克隆 S3A 进行测序，发现其与预测序列有两个单核苷酸多态性（SNPs），一个是沉默突变，另一个影响 ORF85R 导致氨基酸改变（A72T），且 ORF49/50L 基因中缺失了一个 24bp 的串联重复。评估 FV3 - S3A 的生长特性时发现，其生长比亲本病毒受损，产生的噬菌斑有大小两种表型。推测 A72T 突变可能是原因，通过 en passant 诱变修复该突变得到克隆 S3Ar，FV3 - S3Ar 的生长特性与亲本 FV3 一致，因此选择 S3Ar 作为后续构建突变体的亲本细菌克隆。
对 R1A 和 R2A 克隆测序，也发现它们含有少量意外突变，这表明使用高保真聚合酶产生重叠基因组片段时，通过 TAR 克隆组装完整虹彩病毒基因组可行，且突变数量有限，筛选更多克隆可能得到无错误的克隆。
2. FV3 报告基因表达增强绿色荧光蛋白（EGFP）：为测试反向遗传学系统，研究人员用 EGFP 替换 ORF64R 的编码序列构建 FV3 报告突变体。ORF64R 编码一种含有半胱天冬酶激活和募集结构域（CARD）的蛋白，是毒力因子，缺失该基因的 FV3 突变体在自然宿主细胞系中生长动力学延迟，感染非洲爪蟾（Xenopus laevis）蝌蚪时病程减弱。
3. 用同源紫外线照射辅助病毒从 DNA 中拯救感染性 FV3：虹彩病毒难以从转染的裸露 DNA 中拯救，研究人员用 EGFP 构建体，在紫外线照射的同源辅助病毒帮助下尝试从裸露 DNA 中拯救感染性病毒。用紫外线照射的 FV3 - FUB 处理 BHK - 21 细胞，再转染纯化的细菌 FV3 - Δ64R - EGFP DNA，2 天后在转染细胞中观察到广泛的 EGFP 荧光，3 - 4 天出现典型的 FV3 细胞病变效应（CPE），且与 EGFP 表达相关。这证实了用紫外线照射的亲本病毒可从克隆 DNA 中拯救感染性病毒后代，也表明细菌来源的 FV3 DNA 可产生感染性病毒，反向遗传学系统适用于生成各种 FV3 突变体。
但该拯救方法成功的前提是紫外线照射的辅助病毒有一定复制能力，过度照射会使辅助病毒失去帮助拯救的能力，且照射的辅助病毒本身会导致 BHK - 21 细胞出现典型的 FV3 感染 CPE，只是有明显延迟。
4. 用异源鱼类蛙病毒从裸露 DNA 中拯救感染性 FV3：紫外线照射的辅助病毒存在污染和重组问题，研究人员探索用大鳞黑鲈病毒（LMBV，Ranavirus micropterus1）作为异源辅助病毒拯救 FV3。LMBV 与 FV3 序列同一性约 70% - 78%，基因顺序有明显重排。
首先用针对流行性造血坏死病毒（EHNV）的鼠单克隆抗体通过免疫荧光（IF）染色区分 FV3 和 LMBV 感染的细胞，该抗体只与 FV3 发生交叉反应，不识别 LMBV。初步实验表明可用 LMBV 成功拯救 FV3，但消除 LMBV 是挑战，为此开发了定量 PCR（qPCR）筛选系统，可区分同一样品中的 FV3 和 LMBV 基因组，且特异性高。
研究人员还筛选了 10 种细胞系，发现 BHK - 21 细胞最适合消除 LMBV，其能有效支持 FV3 繁殖，同时限制 LMBV 复制，Vero E6 细胞也有一定限制 LMBV 复制的能力，但支持 FV3 繁殖的效率不如 BHK - 21 细胞。
优化后的用 LMBV 辅助从细菌 DNA 中拯救 FV3（FV3 - S3Ar）的方法包括：用 LMBV 感染 BHK - 21 细胞 2h 后转染纯化的 FV3 DNA，转染 2 天后收集细胞培养液感染新鲜 BHK - 21 细胞，重复 3 次；再在 Vero E6 细胞上传代 2 次；最后在 BHK - 21 细胞上传代 3 次，通过 qPCR 确认 LMBV 被完全消除。对最后三次在 BHK - 21 细胞上传代的病毒进行下一代测序（NGS），未检测到 FV3 和 LMBV 之间的重组，证实得到了完整的 FV3 基因组。
对于表达荧光蛋白的 FV3 - Δ64R - EGFP，还探索了细胞分选法纯化病毒。用 LMBV 辅助拯救 FV3 - Δ64R - EGFP 后，在 BHK - 21 细胞上传代，5 天后进行细胞分选，将单个绿色荧光细胞转移到含 BHK - 21 细胞的孔中，再传代一次，qPCR 检测表明所有样品均不含 LMBV，证明细胞分选是消除 LMBV 辅助病毒和纯化荧光标记 FV3 的有效方法。
5. 拯救病毒的特性：评估 BAC - YAC 来源的 FV3 的生长特性，对用紫外线照射的 FV3 - ΔORF64R - EGFP 和 LMBV 分别辅助从 S3Ar 克隆中独立拯救的病毒进行多步生长动力学分析，结果显示，无论使用哪种辅助病毒，拯救的病毒与亲本 FV3 的复制动力学均无显著差异，但用 LMBV 辅助拯救的病毒滴度略高。
对拯救的 FV3 - S3A 和 FV3 - ΔORF64R - EGFP 病毒进行 10 次连续传代，对第 10 代病毒基因组测序未检测到序列变化，且 FV3 - ΔORF64R - EGFP 在传代过程中始终保持较强的 EGFP 表达，表明拯救的野生型样病毒和重组 EGFP 病毒具有较高的遗传稳定性。
讨论
本研究首次为 Megaviricetes 纲的关键成员开发了反向遗传学系统。利用酵母中的 TAR 克隆技术构建了含有完整 FV3 基因组的重组 BAC - YAC 克隆，拯救的病毒在细胞培养中的表型与亲本 FV3 无法区分。该反向遗传学系统可在细菌中对病毒基因组进行遗传操作，避免了在真核细胞中基于重组的繁琐诱变过程。用该系统构建报告病毒，替换 ORF64R 基因生成的重组 EGFP 病毒可在细胞培养中反复重构，且遗传稳定性高，大大提高了病毒基因组操作的效率和速度。
虹彩病毒不能从纯化 DNA 转染中形成复制后代，这限制了反向遗传学系统的实际应用。虽然使用紫外线照射的同源辅助病毒可拯救病毒，但存在辅助病毒残留和重组的问题。本研究使用 LMBV 作为异源辅助病毒，其与 FV3 遗传差异大，降低了拯救过程中不必要重组的风险，同时其蛋白能辅助 FV3 拯救，为 FV3 拯救提供了方便且可重复的方法。
反向遗传学系统对研究虹彩病毒生物学意义重大，FV3 能感染多种变温宿主，在哺乳动物、两栖动物和鱼类细胞系中高效复制，具有疫苗开发潜力。该系统可将感兴趣的基因导入 FV3 基因组，删除或替换特定毒力因子，有助于设计改良活疫苗，这对保护两栖动物种群免受虹彩病毒和其他病原体侵害具有重要意义。
材料和方法
- 细胞和病毒：使用多种细胞系培养不同病毒，如 BHK - 21、MDCK、RK13 等哺乳动物细胞系，BF - 2、CCO 等鱼类细胞系，A6、ICR - 2A 等两栖动物细胞系。FV3 在 BHK - 21 细胞中 30°C 培养，LMBV 在 BF - 2 细胞中 23°C 培养，病毒收获后冻存于 - 80°C，病毒滴度通过噬菌斑测定法确定。
- 测试 FV3 和 LMBV 在不同细胞系中的复制：用 FV3 或 LMBV 以感染复数（MOI）0.1 感染多种细胞系，24h 后更换培养基，2 天后转移 5% 感染培养基至新鲜细胞进行传代，通过 qPCR 监测病毒基因组拷贝数，用噬菌斑测定法确定感染性病毒粒子数量，对 BHK - 21 和 Vero E6 细胞重复传代实验 3 次。
- 噬菌斑测定：对 FV3 和 LMBV 进行 10 倍系列稀释，接种到 90% 汇合的 BHK - 21 或 BF - 2 细胞中，室温孵育 1h，去除接种物后用含 1.5% 甲基纤维素的培养基覆盖，30°C 孵育 7 天，用 4% 甲醛固定细胞，0.75% 结晶紫染色，用显微镜拍照，用 ImageJ 测量噬菌斑面积并计算直径。
- FV3 片段制备、TAR 克隆和克隆筛选：从感染的 BHK - 21 细胞中提取 FV3 DNA，设计引物扩增 14 个重叠片段，与 BAC - YAC 载体进行 TAR 克隆，用 zymolyase 裂解酵母克隆提取 DNA，电转化到大肠杆菌中，用 RFLP 分析筛选正确组装的构建体。
- 优化紫外线照射条件：用 30W 紫外线灯照射 FV3，测试不同照射时间和距离，确定 70cm 距离照射 15min 为最佳条件，此时病毒可用于辅助拯救 FV3，过度照射会使病毒失去辅助能力。
- 用紫外线照射辅助病毒从 BAC - YAC DNA 中拯救 FV3：用紫外线照射的 FV3 - FUB 或 FV3 - ΔORF64R - EGFP 辅助病毒感染 90% 汇合的 BHK - 21 细胞 2h，去除辅助病毒后转染 FV3 BAC - YAC DNA，观察到紫外线照射的病毒仍有一定复制能力，但导致 CPE 的时间比野生型病毒晚约 2 周。
- 用 LMBV 从 BAC - YAC DNA 中拯救 FV3：用 LMBV（MOI 0.5）替代紫外线照射辅助病毒拯救 FV3 BAC - YAC 克隆，拯救后对 FV3 - S3A 或 FV
