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推荐阅读！本文聚焦牛肝脓肿（LAs），综合运用多种技术分离、鉴定出牛肝脓肿中的拟杆菌（Bacteroides），包括新物种 Candidatus B. purulensis 。研究解析其基因组特征，为探究 Bacteroides 在 LAs 发病机制中的作用提供关键依据，极具科研价值。
### 引言
牛肝脓肿（Liver Abscesses，LAs）在育肥牛中较为常见，由肝脏细菌感染引发。在加拿大，其患病率从 2010 - 2011 年的 9.9% 上升到 2016 - 2017 年的 19.3%，给牛肉生产者带来沉重经济负担，还会降低动物生长性能，影响动物福利。
目前认为，LAs 的发生与瘤胃或后肠中淀粉的快速微生物发酵有关，这会导致临床或亚临床酸中毒，降低瘤胃 pH 值，破坏瘤胃和肠上皮的完整性，使机会性病原体如坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum）通过门静脉系统转移到肝脏并定植，引发感染。以往，坏死梭杆菌一直被视为 LAs 的主要病原体，但近期研究发现，LAs 的微生物群落比最初认为的更为复杂，拟杆菌（Bacteroides）在 25% - 50% 的肝脓肿微生物组中占比显著。然而，由于扩增子测序无法准确鉴定拟杆菌属以下的物种，其在 LAs 发病机制中的生物学意义尚不清楚。
拟杆菌是共生的专性厌氧菌，在单胃和反刍动物的肠道微生物组中含量丰富，对肠道健康和消化起着重要作用，能够利用多种宿主和非宿主聚糖作为底物，参与碳水化合物代谢。不过，当拟杆菌突破胃肠道时，也可能引发严重感染，导致菌血症和多种组织脓肿的形成。因此，对 LAs 中拟杆菌的鉴定和特征分析具有重要意义。
材料与方法
- 样本采集：用于宏基因组实验的肝脓肿样本来自商业育肥场实验，实验动物饲喂特定的育肥日粮。屠宰后，经认证的检查员评估肝脏，并在无菌条件下采集脓肿样本，部分用于宏基因组学研究，部分用于细菌分离，采集后分别进行相应处理。
- DNA 提取与纯化：从随机选取的 16 个组织样本中提取肝脓肿宏基因组 DNA，通过一系列步骤去除牛源 DNA，再使用相关试剂盒提取 DNA，对 DNA 质量和纯度进行评估，合格样本储存于 - 80°C 备用。
- 宏基因组测序与生物信息分析：在相关测序中心完成测序和文库构建，使用特定平台获得测序数据。对序列进行质量评估和处理，去除杂质序列，将剩余序列用于生成宏基因组组装基因组（MAGs），并进行注释、功能分析和质量评估等操作。
- 拟杆菌的分离：将用于细菌分离的脓肿样本在 4 小时内运至实验室，接种到特定培养基中，进行富集培养和稀释平板培养。通过 PCR 筛选和 16S rRNA 基因测序，初步鉴定拟杆菌属的菌株。
- 全基因组测序：对初步鉴定为拟杆菌的菌株进行多次纯化，提取基因组 DNA，进行短读长和长读长测序，使用相关软件进行组装和质量评估。
- 功能注释：使用多种工具对基因组进行注释，包括预测开放阅读框（ORFs）、分析代谢途径、鉴定毒力因子（VF）、硫酸酯酶、碳水化合物活性酶（CAZymes）、多糖利用位点（PULs）等，并预测分泌蛋白和亚细胞定位。
- 系统发育分析：使用两种独立工具确定 MAGs 和分离株基因组的分类学地位，构建系统发育树，计算平均核苷酸同一性（ANI），以确定物种分类。
- 生长实验：将两种拟杆菌（B. purulensis 和 B. pyogenes）在厌氧条件下培养，用特定培养基洗涤后，接种到含有不同碳水化合物底物的 96 孔板中，在特定条件下培养并监测生长情况。
结果
- 宏基因组测序与 MAG 组装：对 16 个肝脓肿样本进行宏基因组测序，去除牛源和人源 DNA 后，对剩余序列进行共组装，得到 4 个高质量的 MAGs，其中两个属于拟杆菌属，分别为 B. pyogenes 和一个未知物种。
- MAGs 在样本中的分布：B. pyogenes 和未知拟杆菌物种在部分脓肿样本中的相对丰度较高，而其他样本主要由 F. necrophorum 主导。还有少量样本中检测到 Atopobium 属的 MAG，但丰度较低。
- 功能差异分析：根据脓肿样本中微生物的组成，将其分为 F 型（F. necrophorum 亚型）和 BF 型（Bacteroides 和 Fusobacterium 亚型）。F 型脓肿中，21 个京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能更丰富；BF 型脓肿中，647 个 KEGG 功能更丰富，这些功能多与碳水化合物代谢和细胞外基质中糖胺聚糖（GAGs）的降解有关。
- 拟杆菌的分离：通过直接平板培养和富集培养技术，从 6 个肝脓肿样本中分离出 260 个菌落，其中 53% 初步鉴定为 Fusobacterium sp.，12 个非 Fusobacterium 分离株被鉴定为拟杆菌，分别与 B. pyogenes 和 B. heparinolyticus 相关。
- 全基因组测序与系统发育分析：对拟杆菌分离株进行全基因组测序和系统发育分析，结果表明这些分离株形成两个聚类。一组与 B. pyogenes 的模式菌株聚类，另一组与已知的拟杆菌物种聚类较远，被确定为一个新物种，命名为 Candidatus B. purulensis。
- 代谢潜力分析：选择 B. pyogenes 和 B. purulensis 的代表性基因组进行代谢途径分析，发现它们的核心代谢途径与其他拟杆菌物种高度保守，但部分参与氧化磷酸化的酶缺失。同时，它们在短链脂肪酸（SCFA）的产生途径上也有一定特点，并且在功能分类上聚类在一起，表明可能具有相似的功能作用。
- CAZymes 多样性分析：分析拟杆菌的 CAZomes 发现，基因组大小与 CAZome 含量呈正相关。肠道来源的拟杆菌通常具有较大的基因组和 CAZomes，而肝脓肿来源的拟杆菌基因组和 CAZomes 较小，且主要含有降解 α - 葡聚糖、宿主聚糖和细菌细胞壁肽聚糖的 CAZymes。两种肝脓肿拟杆菌在底物特异性上存在差异，且在多糖利用相关基因的组成和数量上也有所不同。
- 生长实验结果：两种拟杆菌都能快速利用葡萄糖和糖原，但对淀粉的利用效率较低，B. purulensis 对糖原表现出偏好。在 GAG 底物利用方面，它们都能利用部分氨基单糖成分和某些 GAG 多糖，但 B. pyogenes 能利用肝素，B. purulensis 则不能，且它们对不同 GAGs 的利用效率和生长表现存在差异。
- 毒力因子与抗菌耐药基因：在两种肝脓肿拟杆菌中鉴定出多个潜在的毒力因子，包括与免疫调节、应激生存、细菌粘附等相关的因子，且两种菌在毒力因子的组成上存在差异。B. purulensis 预测对四环素耐药，两种菌都对万古霉素有一定抗性，且都编码多种外排泵蛋白，可能与抗菌耐药有关。
讨论
LAs 的高患病率对牛的健康和牛肉生产的经济可持续性产生严重影响。虽然 F. necrophorum 被认为是主要病原体，但 LAs 是由多种微生物引起的。本研究成功分离和鉴定出牛肝脓肿中的两种拟杆菌，为深入了解 LAs 的发病机制提供了重要信息。
研究中未检测到更多拟杆菌物种，可能是由于样本处理过程中的氧气暴露、动物个体差异和样本量较小等原因。未来研究应增加样本数量，减少氧气暴露，以更全面地了解 LAs 中的拟杆菌种类。
拟杆菌和 Fusobacterium 在多种感染中共同出现，表明它们之间可能存在协同关系，促进脓肿的形成。肝脓肿中的拟杆菌与口腔和其他脓肿来源的拟杆菌相似，与肠道拟杆菌不同，它们具有较小的基因组和 CAZomes，主要代谢肝脏中的糖原和 GAGs，这可能有助于细菌在肝脏中生存和入侵。
糖原是肝脏中丰富的 α - 葡聚糖，拟杆菌能够代谢糖原，这一过程可能涉及多种酶的作用。此外，拟杆菌还可能利用 GAGs 作为能量来源，不同拟杆菌对 GAGs 的利用存在特异性差异，这可能减少它们在体内的直接竞争。
拟杆菌编码多种毒力因子，包括蛋白酶、细胞毒素等，这些因子可能参与肝脏组织的破坏和感染的建立。虽然两种拟杆菌对部分抗生素有抗性，但还需要进一步的抗菌药敏试验来准确评估它们的抗菌耐药谱。
结论
本研究首次明确鉴定出牛肝脓肿中的两种拟杆菌，包括新物种 Candidatus B. purulensis 。这些数据为深入了解拟杆菌在 LAs 形成过程中的潜在作用奠定了基础，有助于发现新的治疗靶点，预防这一限制生产的疾病，但仍需进一步研究其毒力机制和细菌间的相互作用。
