基于 mNGS 的机器学习模型预测 5 种 ESKAPEE 细菌药敏性能及潜在临床意义重大

本文聚焦抗菌耐药危机，评估基于宏基因组下一代测序（mNGS）的机器学习模型预测 5 种 ESKAPEE 细菌药敏的性能和临床影响。研究表明该模型准确性达 93.84%，周转时间更短，能为部分患者提供更早治疗调整建议，为个性化抗菌治疗带来新希望。

　　

研究背景

抗菌耐药问题已演变成全球严峻的健康危机，对公众健康构成极大威胁。由美国传染病学会提出的 “ESKAPE” 细菌，包括粪肠球菌（Enterococcus faecium）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，AB）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）和肠杆菌属（Enterobacter spp.），后来概念扩展到 “ESKAPEE”，纳入了大肠杆菌（Escherichia coli，EC）。这些细菌引发的感染与死亡率上升、医疗成本增加密切相关。在缺乏病因证据时进行经验性治疗，往往疗效不佳，所以快速鉴定细菌种类和耐药性对临床有效治疗至关重要。

快速抗菌药敏测试（antimicrobial susceptibility testing，AST）备受关注，相关表型和基因型方法不断发展。快速表型 AST 方法虽能检测细菌生长信号，但在提供全面耐药谱方面存在局限。基因型方法随着人们对基因型 - 表型关联认识的深入而兴起，像全基因组测序（Whole-genome sequencing，WGS）能详细分析耐药突变和菌株分型，但它需要细菌培养和分离，对难培养微生物存在挑战。靶向富集 WGS 虽可直接从临床样本捕获基因组，但依赖对特定病原体的临床怀疑，在评估混合或未知感染时应用受限。

临床宏基因组下一代测序（mNGS）是一种无需分离病原体、无假设的检测方法，能高通量、广谱、高灵敏度地检测病原体，尤其适用于诊断混合感染、未知病原体或传统方法难以检测的低丰度病原体感染。其产生的测序数据不仅可用于病原体鉴定，还具备预测抗菌药敏的潜力。研究团队此前开发了基于 mNGS 的快速预测 AB 药敏的方法，并推广到其他 4 种 ESKAPEE 细菌，但该方法在临床队列中的实用性尚未得到验证。本研究旨在验证该模型在感染 5 种 ESKAPEE 细菌患者队列中的性能和潜在临床影响。

材料和方法

1. 研究设计和人群：回顾性分析郑州大学第一附属医院临床 mNGS 应用观察研究中的患者数据。在 2021 年 7 月至 2023 年 3 月期间，1342 例患者同时进行了细菌培养和临床 mNGS 检测，其中 288 例患者的临床 mNGS 检测结果显示感染了 AB、KP、EC、PA 或 SA。将这些患者的 mNGS 测序数据纳入 mNGS - 基于 AST 的模型进行生物信息学分析，最初纳入 176 例有可用 mNGS - 基于 AST 结果的患者。从性能和潜在临床影响两个角度评估模型的实用性。为评估性能，选取 113 株确诊细菌菌株（来自 101 例患者）；为评估潜在临床影响，排除随访 7 天内病历不完整的患者，根据细菌培养结果分为培养阳性组（n = 78）和培养阴性组（n = 36）。
2. 病原体和抗菌药敏鉴定
   • 细菌培养和基于培养的 AST：使用 Vitek 2 Compact 系统进行细菌鉴定和基于培养的 AST。依据临床和实验室标准协会（CLSI）（M100 - S30 和 M45 - A3）及欧洲抗菌药敏试验委员会（EUCAST）（v10.0）的断点表，使用 AST - N335、AST - GN09 和 AST - GP67 测试卡检测分离菌的药敏，但替加环素和头孢哌酮 / 舒巴坦使用美国食品药品监督管理局（FDA）的断点表。药敏结果报告为敏感（S，正常剂量下敏感）、中介（I，增加暴露量时敏感）或耐药（R，对药物耐药）。
   • 临床 mNGS 和基于 mNGS 的 AST：临床 mNGS 分为测序和生物信息学分析两个阶段。测序采用 MGISEQ - 200 平台，测序后的数据通过生物信息学流程去除人源序列，再与自定义微生物数据库比对并分类，最后根据临床可报告范围进行筛选。基于 mNGS 的 AST 利用临床 mNGS 的测序数据，针对每种抗菌药 - 细菌对构建不同模型，模型采用机器学习方法构建，最初用基于培养的 AST 结果和 WGS 数据训练，通过最小绝对收缩和选择算子（Least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）回归筛选关键遗传特征，选取曲线下面积（Area under the curve，AUC）值最高的模型应用。在应用于 mNGS 短读测序数据时，模拟不同读深以确定合适的测序深度，并通过物种特异性 k - mers 等方法将关键遗传特征归因于相应病原体。若检测到模型中的耐药特征，则报告为 “R - 预测”；若未检测到，根据 AUC 值（以 0.9 为阈值）判断，AUC 值超过 0.9 报告为 “S - 预测”，否则为 “未预测”。
3. 临床数据收集：通过回顾郑州大学第一附属医院的电子病历系统和电子处方系统，收集患者的临床数据，包括一般住院信息（年龄、性别、基础疾病、感染部位、重症监护室病史等）、常规实验室检查结果（白细胞计数（white blood cell count，WBC）、中性粒细胞计数（neutrophil count，NEUT）、C 反应蛋白（C - reactive protein，CRP）、降钙素原（procalcitonin，PCT）水平等）、微生物检查结果及周转时间（细菌培养、基于培养的 AST、临床 mNGS 结果）以及治疗数据（采样当天（D0）和随后 7 天（D1 - D7）的抗菌药物使用情况）。
4. 性能和潜在临床影响评估
   • 主要研究：性能评估：将基于培养的 AST 结果（S、I 或 R）转换为二分结果（S 或 I/R），以便与基于 mNGS 的 AST 二分结果（S - 预测或 R - 预测）比较。当两种方法均显示对特定抗菌药敏感（S vs S - 预测）时为真敏感；均显示耐药（I/R vs R - 预测）时为真耐药。不一致时，定义主要错误（major error，ME，S vs R - 预测）和极主要错误（very major error，VME，I/R vs S - 预测）。若基于 mNGS 的 AST 未产生药敏结果，则分类为未预测，并根据基于培养的 AST 结果进一步分为未预测 - S 或未预测 - R/I。以基于培养的 AST 结果为金标准，计算基于 mNGS 的 AST 的准确性、阳性预测值（positive predictive value，PPV）、阴性预测值（negative predictive value，NPV）和可预测率。同时收集临床 mNGS 的周转时间（采样到获得报告的时间），并认为基于 mNGS 的 AST 周转时间与之相同，比较其与基于培养的 AST 周转时间的差异。
   • 次要研究：潜在临床影响评估：在实际临床管理中，D0 采集标本进行细菌培养和临床 mNGS 检测，D1 获得临床 mNGS 结果后临床医生可进行初步调整，D2 - D7 结合细菌培养结果和患者反应进一步调整治疗方案。为评估模型在指导治疗调整方面的临床益处，进行模拟管理实验，假设 D1 同时获得基于 mNGS 的 AST 结果和临床 mNGS 结果。由两名经验丰富的医生分别根据基于 mNGS 的 AST 或基于培养的 AST 结果提供治疗建议，建议分为降阶梯（换用窄谱抗菌药）、升阶梯（换用广谱抗菌药）和维持（继续当前治疗）三类，对判断不一致的病例进行病例回顾重新评估。在模拟管理中，主要评估确诊病原菌菌株对 D1 使用的抗菌药是否耐药。对于培养阳性组患者，比较两种方法的治疗建议，若建议一致，则认为基于 mNGS 的 AST 能实现更早治疗调整（D1 vs D2 - 7）；对于培养阴性组患者，评估虽无基于培养的结果但能获得可用治疗建议的患者比例。
5. 统计分析：连续变量以中位数（四分位数间距，interquartile range，IQR）或均值（标准差，standard deviation，SD）表示，正态分布变量采用独立 t 检验，显著性水平设为 α = 0.05。分类变量以频率和百分比表示，使用 SPSS 28.0 软件进行统计分析。

研究结果

1. 研究菌株和队列：1342 例患者中，288 例患者的临床标本经临床 mNGS 检测出 5 种 ESKAPEE 细菌，其中 176 例可获得基于 mNGS 的 AST 结果。用于评估基于 mNGS 的 AST 性能的 113 株培养确诊细菌菌株，包括 39 株 AB、36 株 KP、20 株 PA、7 株 EC 和 11 株 SA。用于评估潜在临床影响的 114 例患者中，78 例在培养阳性组，36 例在培养阴性组。患者中男性占 69.30%，中位年龄 54 岁，94.74% 有基础疾病，最常见的是中枢神经系统疾病（42.98%），其次是心血管疾病（28.95%）。多数患者（86.84%）在 D0 前接受过抗菌药物治疗，68.42% 在重症监护室接受治疗。64.04% 的患者诊断为下呼吸道感染，15.79% 为中枢神经系统感染，9.65% 为血流感染。
2. 主要结果：基于 mNGS 的 AST 性能
   • 准确性：与基于培养的 AST 金标准相比，基于 mNGS 的 AST 总体准确性为 93.84%，总体 PPV 为 95.03%，总体 NPV 为 85.71%，还能提供详细的耐药基因数据。在细菌特异性水平上，AB 的准确性为 94.09%，KP 为 95.87%，PA 为 84.38%，EC 为 91.67%，SA 为 92.96%。在抗菌药特异性水平上，氨苄西林、氨曲南、头孢唑林等多种抗菌药的准确性达 100.00%，不同抗菌药准确性存在差异。
   • 时间效率：基于 mNGS 的 AST 周转时间（1.12 ± 0.33 天）显著短于基于培养的 AST（2.81 ± 0.57 天）。在单个细菌层面，AB、KP、PA、EC 和 SA 的基于 mNGS 的 AST 周转时间均显著短于基于培养的 AST。
   • 可预测率：基于 mNGS 的 AST 总体可预测率为 68.02%，其中基于培养的 AST 分类为 R 或 I 的项目可预测率为 83.42%，分类为 S 的项目可预测率为 33.56%。在细菌特异性水平上，不同细菌的可预测率不同，PA 的可预测率较低（32.00%）。在抗菌药特异性水平上，粘菌素的可预测率最低（6.10%）。
3. 次要结果：基于 mNGS 的 AST 潜在临床影响：在培养阳性组 78 例患者的模拟管理中，基于 mNGS 的 AST 结果可覆盖 26 例（33.33%）患者 D1 的实际抗菌药物使用情况。根据该结果，17 例患者（21.79%）可接受升阶梯建议，3 例（3.85%）可接受降阶梯建议，5 例（6.41%）可接受维持治疗建议，但有 1 例患者（P041）的药敏预测结果与基于培养的 AST 存在差异，可能影响临床管理。总体上，基于 mNGS 的 AST 能使 32.05%（25/78）的培养阳性患者更早调整治疗方案，两种方法建议的一致性为 96.15%（25/26）。在培养阴性组 36 例患者的模拟管理中，基于 mNGS 的 AST 结果可覆盖 6 例（16.67%）患者 D1 的实际抗菌药物使用情况，能为 6 例（16.67%）患者提供抗菌药物调整建议，其中 2 例（5.56%）升阶梯，4 例（11.11%）维持治疗。

讨论

细菌耐药，尤其是 ESKAPEE 细菌的耐药问题，严重影响危及生命的感染治疗效果，是全球健康面临的关键挑战，因此快速准确鉴定抗菌药敏对指导感染治疗愈发重要。本研究首次评估了基于 mNGS 的机器学习方法在预测 ESKAPEE 细菌药敏方面的适用性。

与基于培养的 AST 相比，基于 mNGS 的 AST 在准确性和周转时间方面表现良好，能显著缩短周转时间并保持较高准确性。但该方法也存在一些问题。一是可预测率较低，尤其是 PA 和粘菌素。mNGS 序列中含大量人源序列，影响微生物耐药基因（antimicrobial resistance gene，ARG）的检测，导致许多抗菌药 - 细菌对被分类为 “未预测”。二是不同细菌和抗菌药的性能存在差异，PA 的准确性相对较低，这与 PA 复杂的耐药机制有关，其涉及多种能量依赖的主动外排泵和低通透性外膜屏障的协同作用，给基因型 AST 带来挑战。此外，模型对粘菌素药敏预测表现不佳，部分原因是革兰阴性菌对粘菌素的耐药率低且其耐药机制尚不清楚。同时，基于 mNGS 的 AST 在基于培养的 AST 分类为 S 的抗菌药 - 细菌对中的表现较差，NPV 较低，可预测率也较低，这是由于报告 “S - 预测” 结果时较为谨慎，且临床标本中微生物数据不足，算法也有待进一步优化。例如患者 P041，模型错误地将 EC 的 ARG 归因于粪肠球菌，导致预测结果错误，说明需要提高模型的物种分配准确性和 ARG 识别能力。

基于 mNGS 的 AST 模型对感染 ESKAPEE 细菌患者的临床管理有积极影响。一方面，因其周转时间短且适用于部分培养阴性病例，能在更多病例中实现更早治疗调整。在培养阳性组，多数预测结果与基于培养的 AST 一致，能使部分患者更早接受针对性治疗；在培养阴性组，能为部分患者提供药敏结果。对于培养阴性但高度怀疑感染的患者，重复细菌培养耗时且信息有限，临床 mNGS 和基于 mNGS 的 AST 可作为二线检测手段。另一方面，基于 mNGS 的 AST 可补充临床 mNGS，为临床医生提供更精确的用药建议，简化报告解读，增强 mNGS 技术指导治疗决策的能力。

本研究存在一定局限性。一是单中心研究且样本量较小（113 株确诊细菌菌株和 114 例患者），患者抗菌药物使用史和重症监护室病史比例较高，可能存在偏倚，限制了研究结果的普遍性，未来需开展多中心大样本研究。二是与 VITEK 系统比较，该系统虽广泛应用且可靠，但不能完全准确反映真实药敏情况<