揭秘伴放线聚集杆菌 ArcAB 双组份系统：氧化应激抗性与牙周疾病关联的关键线索

本文聚焦伴放线聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans），研究其 ArcAB 双组份系统（TCS）。发现 ArcAB 影响细菌对超氧阴离子（O2•? ）和过氧化氢（H2O2 ）的敏感性，还关乎细菌在巨噬细胞中的存活，为揭示牙周致病菌生存策略提供重要依据。

　　

引言

伴放线聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）是一种革兰氏阴性兼性厌氧菌，与牙周疾病尤其是侵袭性牙周炎密切相关。它可分为 7 种血清型，不同血清型在牙周炎中的作用各异。该菌凭借多种毒力因子逃避宿主免疫反应，引发牙周组织的炎症和破坏。

在口腔环境中，细菌面临多种环境压力，其中活性氧（ROS），如超氧阴离子（O₂^•?）、过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（OH^•），能通过氧化核酸、蛋白质和脂质发挥抗菌作用。伴放线聚集杆菌拥有多种抗氧化酶，如过氧化氢酶（katA）、超氧化物歧化酶（SOD）和喹啉过氧化物酶等，以应对 ROS 压力，但这些抗氧化基因的调控机制尚不明确。

双组份系统（TCSs）在细菌适应环境压力中至关重要，通常由膜结合组氨酸激酶（HK）和反应调节蛋白（RR）组成。在伴放线聚集杆菌中，QseBC 是研究较多的 TCS，影响生物膜形成和牙周组织骨丢失 。ArcAB 存在于某些 γ - 变形菌中，在大肠杆菌等菌中参与调节氧气利用、呼吸和能量代谢，还与 ROS 抗性和毒力相关，但在伴放线聚集杆菌中的功能有待研究。

结果

1. 基因表达：培养伴放线聚集杆菌 NUM4039 野生型（WT）、arcA 和 arcB 突变体（ΔarcA 和 ΔarcB）及其互补菌株。RNA 测序（RNA - seq）分析发现，ΔarcA 中编码 SOD 的 sod 基因表达增加 2.84 倍，qRT - PCR 验证了该结果。ΔarcB 中 arcA 表达增加 2.31 倍，arcB 表达在 ΔarcA 中无变化，在 arcB 互补菌株中增加。
2. 对 O₂^•?的敏感性：构建 sod 突变体（Δsod），测试各菌株对 O₂^•?的敏感性。结果显示，Δsod 存活率显著降低，而 ΔarcA 和 ΔarcB 存活率高于 WT，互补菌株存活率恢复至 WT 水平，表明 sod 基因表达增加与 ΔarcA 和 ΔarcB 对 O₂^•?敏感性相关。
3. 对 H₂O₂的敏感性：进行两种 H₂O₂敏感性测试。在滤纸片扩散实验中，ΔarcA 和 ΔarcB 对 3% H₂O₂的生长抑制区小于 WT，Δsod 大于 WT。与产 H₂O₂的血链球菌（Streptococcus sanguinis）共培养实验表明，ΔarcA 对血链球菌产生的 H₂O₂敏感性降低，Δsod 敏感性增加。
4. 在巨噬细胞中的生存：检测菌株在 THP - 1 巨噬细胞中的生存情况，发现 ΔarcA 存活率增加，Δsod 存活率降低，互补菌株存活率与 WT 相似，说明 ArcA 介导的 sod 调节影响细菌在巨噬细胞内的生存。
5. ArcA 磷酸化评估：使用 Phos - tag 凝胶和免疫印迹分析 ArcA 磷酸化水平。在 WT 中可检测到磷酸化和非磷酸化 ArcA，ΔarcB 中磷酸化 ArcA 水平显著降低，非磷酸化 ArcA 水平增加，表明 ArcB 可能磷酸化 ArcA，但可能还有其他因素参与 ArcA 磷酸化。

讨论

本研究分析了伴放线聚集杆菌 ΔarcA 突变体的转录组，发现 ArcA 调节参与碳源代谢和甲酸脱氢酶的基因表达，但 ΔarcA 突变体生长动力学未改变。同时，nrdDG 操纵子基因在 ΔarcA 中下调，暗示在巴斯德菌科中其表达可能受 ArcAB 控制。

研究还发现，ΔarcA 中 sod 表达增加，对 O₂^•?和 H₂O₂敏感性降低，这与其他细菌中 arcA 突变的结果不同，表明 ArcA 对 sod 的负调控是伴放线聚集杆菌的特征。在铁限制条件下，sod 表达模式与对照相似，提示 ArcA 对 sod 的调控可能在体内也发生。

此外，ArcA 激活通过调节 sod 表达影响细菌在巨噬细胞中的生存。ΔarcB 表现出与 ΔarcA 相似的表型趋势，ArcB 失活导致 arcA 表达增加，ArcA 磷酸化水平降低，但磷酸化 ArcA 未完全消失，表明 ArcA 表达受磷酸化 ArcB 负调控，且可能有其他激酶参与 ArcA 磷酸化。

综上所述，ArcA 部分从 ArcB 接收磷酸基团，调节包括 sod 在内的基因表达，有助于调节对 H₂O₂和 O₂^•?的应激反应。伴放线聚集杆菌作为兼性厌氧菌，可能在厌氧条件下抑制 sod 表达以节省能量。

材料和方法

1. 细菌菌株和培养条件：本研究使用多种细菌菌株，伴放线聚集杆菌在 AAGM 培养基中 37°C、5% CO₂培养，血链球菌在 TSB 培养基中相同条件培养，大肠杆菌在 LB 肉汤中振荡培养，根据菌株和质粒需求添加相应抗生素。
2. 敲除菌株构建：通过重叠延伸 PCR 将目标基因替换为来自粪肠球菌的壮观霉素抗性基因（aad9）构建敲除菌株，经菌落 PCR 验证。
3. 互补菌株构建：利用广宿主范围质粒 pJAK16 和辅助质粒 pRK2013 构建互补菌株，通过 PCR 确认基因互补。
4. 生长动力学：监测 WT 和突变体菌株在 AAGM 肉汤中的 OD₆₆₀变化 24 h，在铁限制条件下，用 2,2′ - 联吡啶处理菌株。
5. RNA - seq 分析：提取 WT 和 ΔarcA 突变体菌株的总 RNA 进行 RNA - seq 分析，计算 FPKM 值并排除低于 10 的值，以 FPKM 比率表示差异基因表达。
6. qRT - PCR：提取菌株总 RNA，去除基因组 DNA 后合成 cDNA，进行 qRT - PCR，以 gapdh 为内参，用 ΔΔC_T法确定相对转录水平。
7. 超氧化物杀伤试验：将菌株与黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶孵育，计算存活率评估对 O₂^•?的敏感性。
8. H₂O₂敏感性测试：通过滤纸片扩散实验和与血链球菌共培养实验，测量生长抑制区距离评估菌株对 H₂O₂的敏感性。
9. 细菌在 THP - 1 巨噬细胞中生存评估：诱导 THP - 1 细胞分化为巨噬细胞，感染伴放线聚集杆菌菌株，用庆大霉素杀死胞外细菌，裂解巨噬细胞后计算胞内细菌存活率。
10. 重组 ArcA 和抗血清制备：构建 His 标记的重组 ArcA，纯化后制备兔抗血清。
11. 免疫印迹：制备细菌全细胞提取物，进行 SDS - PAGE 或 Phos - tag 凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜，用 ArcA 抗血清和辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，检测 ArcA 信号并量化。
12. 统计分析：使用 EZR 软件进行单因素方差分析和 Tukey 多重比较检验，P < 0.05 为有统计学意义。