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本文聚焦耐药结核病（TB）治疗难题。贝达喹啉（bedaquiline）是耐药 TB 治疗新方案的基石，但耐药问题凸显。研究发现 MmpS5L5 外排泵与耐药相关，常用药维拉帕米（verapamil）能抑制该泵，增强贝达喹啉等药物活性，为耐药 TB 治疗提供新思路。
研究背景
耐药结核病（TB）是全球公共卫生面临的严峻挑战。全球范围内，3.6% 的新发病例和 18% 的复治病例为耐多药结核病（MDR - TB）。过去，MDR - TB 治疗手段有限，治疗周期长，药物毒性大，治疗效果不佳。贝达喹啉作为一种新型抗结核药物，作用于结核分枝杆菌的 ATP 合酶，是高效治疗耐药结核病新方案的核心药物。然而，自 2012 年获批以来，贝达喹啉耐药问题迅速出现，严重影响治疗效果，导致治疗失败和疾病复发风险增加。
临床研究发现，贝达喹啉耐药主要不是由其作用靶点 ATP 合酶（atpE）的突变引起，而是由于转录抑制因子 Rv0678 失活突变，使得 MmpS5L5 外排泵操纵子上调。MmpS5 和 MmpL5 蛋白可形成复合物，其生理功能是输出铁载体羧基分枝菌素和分枝菌素，同时也能将贝达喹啉及其他多种结构和功能不同的药物排出菌体，导致细菌对这些药物的敏感性降低。因此，深入研究 MmpS5L5 外排泵在耐药中的作用及寻找有效抑制该泵的药物，对改善耐药结核病治疗具有重要意义。
研究结果
- MmpS5L5 外排泵降低细菌对贝达喹啉及其衍生物的敏感性：研究人员以之前分离的移码突变体（Rv0678 G65GfsX10）为研究对象，测试多种药物的最低抑菌浓度（MIC）。结果显示，该突变体对贝达喹啉的 MIC 增加了 8 倍，对处于临床试验阶段的更有效的贝达喹啉衍生物 TBAJ - 867 和 TBAJ - 587 的 MIC 分别增加了 8 倍和 4 倍，对氯法齐明、PBTZ - 169 和 OPC - 167832 等药物的敏感性也降低。MmpS5L5 基因敲除突变体对贝达喹啉、氯法齐明、TBAJ - 876 和 TBAJ - 587 的敏感性增加；而敲除突变体中过表达 MmpS5L5 后，对这些药物以及 DprE1 抑制剂 OPC - 167832 或 PBTZ - 169 的敏感性降低，表明 MmpS5L5 外排泵在介导细菌对多种抗结核药物耐药中发挥重要作用。
- MmpS5L5 基因敲低逆转 Rv0678 突变体的耐药性：为探究 Rv0678 突变体耐药是否仅由 MmpS5L5 上调引起，研究人员利用 CRISPR 干扰（CRISPRi）技术分别在野生型和 Rv0678 突变体菌株中对 MmpL5 和 MmpS5 进行基因敲低。结果发现，在野生型菌株中，转录抑制 MmpS5 或 MmpL5 会使细菌对贝达喹啉、氯法齐明和 TBAJ - 876 的敏感性增加 4 倍以上，对 PBTZ - 169 的敏感性有较小幅度（0 - 2 倍）增加；在 Rv0678 突变体中，敲低 MmpS5 或 MmpL5 同样使细菌对所有测试药物的敏感性增加，且 PBTZ - 169 的 MIC 下降 4 倍，且各药物的 MIC 均低于野生型菌株，证明 MmpS5L5 过表达是 Rv0678 突变体介导耐药的唯一原因。
- 维拉帕米及其代谢物去甲维拉帕米抑制 MmpS5L5 外排，增加抗结核药物敏感性：基于 MmpS5L5 基因敲低能增加药物敏感性，研究人员推测抑制 MmpS5L5 外排的药物也能增强抗结核药物活性。维拉帕米是一种用于治疗高血压、心律失常和偏头痛的廉价口服药，此前研究发现它能增强结核分枝杆菌对多种药物的活性，提示其可能抑制 MmpS5L5 泵活性。通过棋盘格实验，研究人员发现，在野生型细菌中，维拉帕米浓度达到 6 - 12.5 μM 时，贝达喹啉 MIC 开始呈剂量依赖性下降；在 MmpS5L5 过表达的菌株（Rv0678 突变体和 MmpS5L5 敲除互补突变体）中，维拉帕米浓度为 3 - 6 μM 时就能增强贝达喹啉敏感性，在 12.5 - 25 μM 时可使野生型 MIC 恢复。对其他药物底物也观察到类似现象，而在 MmpS5L5 敲除菌株中，维拉帕米对药物 MIC 的降低作用较弱，表明其主要通过抑制 MmpS5L5 发挥作用。
体内实验中，维拉帕米迅速代谢为去甲维拉帕米，后者钙通道抑制活性大幅降低，但保留了 P - 糖蛋白（P - gp）抑制活性。研究发现去甲维拉帕米与维拉帕米一样，能有效抑制利福平外排，且在增强贝达喹啉及其衍生物活性方面与维拉帕米效力相似。此外，质子泵抑制剂类药物虽能更有效地抑制利福平外排，但在测试中，雷贝拉唑在高达 100 μM（其对结核分枝杆菌的 MIC）的浓度下，都不能增强贝达喹啉活性，说明维拉帕米在改善贝达喹啉治疗方面更具潜力。4. 维拉帕米不破坏驱动 MmpS5L5 活性的质子动力势：先前有研究提出维拉帕米可能通过耗散分枝杆菌膜电位间接抑制药物外排，但该研究存在数据和结论问题。本研究中，研究人员首先重复了之前用吖啶橙（AO）淬灭实验的方法，观察到维拉帕米能使耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）的跨膜 pH 梯度（?pH）呈浓度依赖性下降，与阳性对照羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）效果相当。然而，当使用放射性探针定量分析质子动力势（PMF）的各个组分（?pH 和膜电位（?Ψ））时发现，在葡萄糖供能的细胞悬液中，钾离子载体缬氨霉素和维拉帕米对?pH 均无显著影响，而 CCCP 和尼日利亚菌素可使?pH 崩溃；在膜电位方面，缬氨霉素和 CCCP 可使膜电位崩溃，而尼日利亚菌素和维拉帕米对其无显著影响。此外，质子载体化合物可刺激质子泵并激活呼吸链耗氧以维持 PMF，而增加维拉帕米浓度（1 - 10 μM）并不会刺激耻垢分枝杆菌的氧消耗率（OCR），表明维拉帕米不会破坏 PMF（膜电位或?pH），也不会刺激 OCR，即不会使 MmpS5L5 功能的驱动力失活。
研究讨论
Rv0678 突变体导致 MmpS5L5 外排泵表达上调，严重威胁贝达喹啉的长期临床应用。本研究证实 MmpS5L5 外排泵上调不仅影响贝达喹啉，还使细菌对多种临床使用或临床试验中的抗结核药物产生低水平（2 - 8 倍）耐药，且在野生型菌株中 MmpS5L5 活性也会降低药物疗效，提示抑制该泵可能提高贝达喹啉及其他抗结核药物在野生型和 Rv0678 突变体菌株中的治疗效果。
维拉帕米作为一种 FDA 批准的廉价药物，不仅能抑制利福平外排，增强贝达喹啉和氯法齐明活性，还能增强所有测试的 MmpS5L5 药物底物的活性，包括有前景的贝达喹啉衍生物和正在临床试验中的 DprE1 抑制剂。本研究排除了维拉帕米通过破坏 PMF 抑制外排的可能性，表明其直接抑制 MmpS5L5 活性。维拉帕米的主要代谢物去甲维拉帕米在增强贝达喹啉及其衍生物疗效方面与维拉帕米效果相同，且去甲维拉帕米在血浆中的水平更高，可能增强维拉帕米抑制 MmpS5L5 活性的效果。此外，维拉帕米及其对映体和代谢物在无抗生素存在时也能抑制巨噬细胞中结核分枝杆菌的生长，且在小鼠感染模型中，维拉帕米可增强贝达喹啉的疗效，更大程度降低细菌载量。同时，维拉帕米可能通过抑制 CYP3A4 影响贝达喹啉的药代动力学，减少其向活性较低的 M2 代谢物转化。
综合来看，维拉帕米具有价格低廉、临床使用经验丰富、安全性高、药代动力学特征明确等优点，有望成为辅助治疗药物，预防和治疗对贝达喹啉及其他 MmpS5L5 底物的耐药性。本研究也为进一步开发强效 MmpS5L5 抑制剂，与含贝达喹啉的治疗方案联合使用提供了理论依据和研究方向。
