探秘卡里翁病新 “元凶”：罗沙利马巴尔通体（Bartonella rochalimae）的基因组学新洞察

这篇研究聚焦卡里翁病病原体。研究从秘鲁患者样本中鉴定出 5 株罗沙利马巴尔通体（B. rochalimae），分析其基因组特征，发现其在秘鲁部分地区传播，且犬科动物可能参与传播。研究强调需优化诊断和监测手段，对防控该疾病意义重大。

　　### 引言
巴尔通体（Bartonella）属包含二十多种细菌，多由节肢动物传播，部分与人类疾病相关，如罗沙利马巴尔通体（B. rochalimae）、汉赛巴尔通体（B. henselae）等。B. rochalimae是一种革兰氏阴性多形性细菌，2007 年首次从一名前往秘鲁后出现卡里翁病样症状的美国女性血液样本中分离出来。

卡里翁病通常由杆菌状巴尔通体（B. bacilliformis）经白蛉（Lutzomyia sp.）传播，呈双相性，包括急性期的奥罗亚热和慢性期的秘鲁疣，主要流行于南美洲安第斯地区，秘鲁近年病例数有所增加。以往认为B. bacilliformis是卡里翁病的唯一病原体，但B. rochalimae等也被发现可引发类似症状。此前已有B. rochalimae感染人体的病例报道，且从家养动物的跳蚤中分离出该菌，表明跳蚤可能是传播媒介。本研究旨在报告从卡里翁病患者中分离出的B. rochalimae菌株，并对其基因组特征进行分析。

材料和方法

1. 细菌分离与培养：研究选取秘鲁国家卫生研究院（INS）媒介传播细菌性疾病实验室（LRNMEZOB）生物样本库中诊断为卡里翁病患者的样本，从中筛选B. rochalimae菌株。利用 OpenEpi 工具确定基因组测序样本量，通过分层抽样随机选取 155 株细菌分离物。样本在双相培养基中复苏培养，包括哥伦比亚琼脂、酵母提取物、羊血的固相和含 L - 谷氨酰胺、碳酸氢钠的 RPMI 1640 液相，培养后再接种到特定琼脂平板继续培养。同时从实验室信息系统和流行病学记录中获取相关数据。
2. DNA 提取与全基因组测序：使用 GeneJet NGS Cleanup Kit 提取基因组 DNA，用 Qubit 荧光计检测质量和浓度。先通过 PCR 扩增 ial_B基因确认B. bacilliformis分离物，对 ial_B基因检测阴性的样本，再用巢式 PCR 扩增内部转录间隔区（ITS）进行二次确认。利用 Illumina NovaSeq 600 System S4 对 155 株菌株进行短读长基因组测序，制备配对末端基因组文库，但本研究仅纳入非B. bacilliformis菌株。
3. 数据质量控制与基因组组装：运用 FASTQC v0.11.9 评估测序质量，用 Trimmomatic v0.39 处理读数，KRAKEN2 v0.11.9 进行分类学序列分类。使用 SPADES v0.11.9 进行从头组装，用 QUAST v0.11.9 评估基因组组装情况，QUALIMAP v0.11.9 分析覆盖深度。
4. B. rochalimae 样本鉴定：从美国国家生物技术信息中心数据库（NCBI）获取 326 个巴尔通体属基因组组件，用 ROARY 软件进行泛基因组分析，用 SNP - sites 软件基于单核苷酸多态性（SNP）矩阵进行探索性系统发育分析，构建最大似然系统发育树。通过 Ortho - ANI 距离估计筛选与参考菌株相关的基因组，再次进行泛基因组分析并深入研究潜在进化枝。
5. 基因特征分析：用 R 语言特定函数识别核心基因和进化枝特异性编码序列（CDS）。利用 eggNOG - mapper v2 进行基因本体（GO）分析，将编码序列与毒力因子数据库（VFDB）比对鉴定毒力因子，通过 BUSCA 服务器预测亚细胞定位。还进行主成分分析（PCA）以确定进化枝间有区分性的 GO 类别。
6. 总证据系统发育分析：从 NCBI 检索B. rochalimae的多个基因序列，与相关基因组相似区域比对，用 MAFFT v7.525 程序比对序列，SequenceMatrix 进行拼接，构建 “总证据系统发育树”。

结果

1. 从卡里翁病患者中分离出 B. rochalimae：对疑似卡里翁病患者样本基因组分析发现，有 5 株菌株为B. rochalimae，其基因组和原始测序数据可在特定数据库获取。这些菌株在琼脂平板上的菌落形态与B. bacilliformis相似，ial_B基因检测阴性，ITS 区域扩增条带大小与B. bacilliformis不同。5 株菌株分别来自秘鲁卡里翁病流行地区安卡什、卡哈马卡和瓦努科，均来自女性患者，但临床症状各异。研究还发现酶联免疫吸附试验（ELISA）和血涂片检测B. rochalimae的敏感性低于细菌培养，且 ELISA 特异性较低，易出现交叉反应。

系统发育分析显示，部分从 NCBI 检索到的菌株经 Ortho - ANI 分析，其中一株（G70）不属于B. rochalimae，其余包括患者分离株和部分哺乳动物来源菌株与参考菌株 ATCC BAA - 1498 相关。最大似然系统发育树显示存在一个远缘菌株和四个进化枝，各进化枝与特定宿主相关。
2. 基因本体、毒力因子和亚细胞定位：GO 分析显示所有序列中有 18 个功能注释，多数基因功能未知，各菌株间功能注释相关基因数量相似。在人类相关进化枝中发现一个基因具有两种功能和一个未知功能。亚细胞定位分析表明各菌株亚细胞定位数量相似，人类来源分离株与部分进化枝有共同特征。不同菌株毒力因子存在差异，患者分离株和 ATCC BAA - 1498 中缺失部分毒力因子，部分瓦努科菌株含有独特的 lvhB4 因子。PCA 分析显示 PC1 和 PC2 解释了大部分变异，PC1 涉及细胞内运输等功能，PC2 涉及转录等功能，菌株根据基因情况聚集，且部分功能元件与巴尔通体相关蛋白有关。
3. 人类和其他哺乳动物分离株间的系统发育关系：总证据系统发育树显示有两个大的进化枝，一个与啮齿动物相关，另一个与人类、犬科动物、鼬科动物、臭鼬、浣熊等及吸血节肢动物相关，患者分离株和犬科动物来源菌株在同一进化枝。

讨论

长期以来，卡里翁病一直与B. bacilliformis相关，诊断策略主要针对检测该菌。但B. rochalimae等也可引发类似症状，本研究中 5 株B. rochalimae的发现提示需加强分子诊断和监测系统，以检测其他巴尔通体物种，尤其是 ELISA 和血涂片检测 IgM 阴性的病例。

这 5 株B. rochalimae菌株来自秘鲁不同地区，表明该菌在秘鲁流行地区可能存在传播。目前对B. rochalimae基因功能了解有限，多数编码序列定位于质膜和细胞质，大量未知功能蛋白凸显其作为被忽视病原体的现状，了解其蛋白结构特征对理解感染机制和开发治疗策略至关重要。

毒力因子分析显示人类分离株与其他哺乳动物分离株存在差异，部分毒力因子在患者分离株和参考菌株中缺失，可能与特定人类感染有关，而 lvhB4 因子仅在部分瓦努科菌株中存在。系统发育树表明犬科动物可能在B. rochalimae传播给人类过程中起作用，但还需进一步研究证实，此前也有研究在犬类和跳蚤中发现该菌感染。

结论

本研究对与卡里翁病相关的新兴人类病原体B. rochalimae的基因组进行了分析，在秘鲁卡里翁病流行地区鉴定出 5 株该菌，证实其在当地传播，且犬科动物可能参与传播过程。基因组数据显示对B. rochalimae基因功能了解不足，需进一步研究其致病性。人类分离株中部分毒力因子缺失和菌株的系统发育聚类特征提示其可能存在宿主特异性适应。这些发现强调了开发更精准诊断工具和加强监测系统的重要性，鉴于该菌的传播潜力，深入研究其流行病学和毒力对改善公共卫生应对至关重要，综合考虑人、动物和环境健康的综合方法对防控该疾病至关重要。