基于RABV-G-LT双免疫原mRNA疫苗的狂犬病毒高效清除与免疫保护机制研究

编辑推荐：针对传统狂犬疫苗需多次接种、成本高的问题，上海公共卫生临床中心团队开发了同时靶向糖蛋白(RABV-G)和大蛋白T细胞表位(RABV-LT)的mRNA疫苗RABV-G-LT。研究表明该疫苗在小鼠和非人灵长类中可诱导持久中和抗体(>0.5 IU/mL)及强效T细胞反应，7天内实现脑组织病毒RNA降低20倍，单次免疫20周后仍保持完全保护，为开发新型狂犬疫苗提供了创新策略。

　　

狂犬病仍是全球最致命的传染病之一，死亡率接近100%。尽管现有灭活疫苗有效，但繁琐的接种程序（如5针Essen方案）和高昂的暴露后预防成本，使发展中国家难以普及。更棘手的是，传统疫苗主要依赖糖蛋白(RABV-G)诱导中和抗体，而忽视了对清除病毒感染细胞至关重要的T细胞免疫。随着mRNA技术发展，虽然已有CV7201等靶向RABV-G的mRNA疫苗进入临床试验，但如何通过多靶点协同提升免疫效果仍是未解难题。

上海公共卫生临床中心徐建青团队创新性地将目光投向狂犬病毒保守的大蛋白(L protein)。通过生物信息学分析PM1503等5个毒株的L蛋白序列，团队预测出覆盖90%人群HLA-I/II超型的T细胞表位，构建了包含L₆₆₀-Q₉₅₀表位的重组免疫原RABV-LT。Western blot证实该蛋白可在293T细胞表达。令人振奋的是，单独接种RABV-LT mRNA即可诱导特异性CD8⁺ T细胞反应（IFN-γ⁺占比1.25%），使70%小鼠抵抗20 MLD₅₀病毒攻击。

研究进一步将RABV-LT与RABV-G通过EMCV IRES串联，开发出双免疫原mRNA疫苗RABV-G-LT。DHFR降解域的引入增强了抗原呈递。在BALB/c小鼠中，3μg剂量接种7天后即产生0.96 IU/mL中和抗体，显著优于灭活疫苗(0.7 IU/mL)。更关键的是，攻毒实验显示该疫苗能实现：①脑组织病毒RNA载量较灭活疫苗降低20倍；②100%存活率（灭活疫苗仅62.5%）；③早期体重恢复更快。RNAscope ISH证实疫苗组脑组织几乎无病毒NP RNA信号。

在食蟹猴模型中，10μg剂量两针免疫后VNTs达25.5 IU/mL，且RABV-LT特异性T细胞反应持续26周不衰减。7个月后加强免疫引发74-330倍抗体飙升，显示强大免疫记忆。研究通过ELISPOT、ICS等技术证实，双免疫原设计既能激活Th1型免疫（IgG2a/IgG1比值高），又维持了CD4⁺/CD8⁺ T细胞多因子反应（TNF-α>IFN-γ>IL-2）。

该研究突破性地揭示：①L蛋白保守表位是理想的T细胞免疫靶点；②双免疫原协同作用可加速病毒清除（通过体液免疫阻断神经侵袭，T细胞清除潜伏感染）；③mRNA平台能实现早期快速保护（7天生效）与持久免疫（20周有效）。这些发现为开发"一针有效"的狂犬疫苗提供了新范式，尤其适用于医疗资源匮乏地区。论文发表于《Communications Medicine》，相关技术已申请中国专利。

关键技术方法：采用NetMHC pan 4.1/4.0预测HLA限制性表位；构建含IRES和DHFR域的双表达载体；通过LNPs递送m1Ψ修饰mRNA；使用FAVN法检测中和抗体；采用ICS和ELISPOT分析T细胞亚群；建立40 MLD₅₀ CVS-11攻毒模型；运用RNAscope ISH进行组织病毒定位。

主要研究结果：

1. RABV-LT免疫原设计：通过多毒株序列比对获得保守表位，SimPlot++分析显示表位区相似性>90%。Western blot验证重组蛋白表达，小鼠实验证实其可诱导以IFN-γ为主导的T细胞反应。
2. 双免疫原疫苗构建：IRES介导的共表达系统经TMP132稳定化验证，RABV-G-LT mRNA转染后能同时检测到G蛋白和FLAG标记的LT蛋白。
3. 小鼠免疫保护：单次免疫20周后，RABV-G-LT组脑组织病毒RNA较对照组降低7.1倍，且病理切片显示无血管周围袖套现象。存活率显著优于RABV-G单独免疫组（P<0.0001）。
4. 非人灵长类免疫：10μg组二次免疫后GMT达25.5 IU/mL，且RABV-G特异性SFCs在26周仍维持327/10⁶ PBMCs的高水平。

结论与意义：该研究首次将狂犬病毒转录酶（L蛋白）转化为疫苗靶点，通过mRNA技术实现双免疫原协同。其核心价值在于：①突破传统疫苗仅依赖中和抗体的局限，通过表位优化激活细胞免疫；②缩短免疫程序，单剂即可诱导快速持久的保护；③为神经侵袭性病毒疫苗开发提供普适性策略。未来需在更多动物模型（如犬类）验证效果，并优化免疫原比例以平衡体液/细胞免疫应答。