人源成年肌肉型烟碱受体静息与脱敏状态的结构解析及先天性肌无力综合征变异机制研究

本研究通过冷冻电镜技术首次解析了人源成年肌肉型烟碱型乙酰胆碱受体（AChR）在α-银环蛇毒素（αBuTx）结合的静息状态和乙酰胆碱（ACh）结合的脱敏状态的高分辨率结构，揭示了受体从脱敏状态恢复的构象变化。结合电生理学分析，阐明了8个先天性肌无力综合征（CMS）相关AChR变异体的致病机制，为精准诊疗提供了结构基础。此外，研究发现α亚基N端存在铜镍结合（ATCUN）模体，并观察到重组表达中受体亚基的异源五聚体组装现象，为神经肌肉信号转导研究开辟了新视角。

　　

研究背景

烟碱型乙酰胆碱受体（AChR）作为神经肌肉接头（NMJ）的关键信号分子，是由α₂βδε亚基组成的五聚体配体门控离子通道（pLGIC）。其功能异常会导致先天性肌无力综合征（CMS），全球发病率约2-22例/百万。尽管Torpedo电鳐和牛源AChR结构已有报道，但人源结构长期缺失，而92%的序列相似性可能掩盖物种间功能差异。

静息态结构解析

研究团队通过构建稳定表达人源α₂βδε AChR的细胞系，利用冷冻电镜分别解析了DDM去垢剂（2.96 ?）和纳米盘（2.48 ?）重构的αBuTx结合静息态结构。受体呈现经典的顺时针排列（α-β-δ-α-ε），其中αBuTx通过R36与αY198形成阳离子-π相互作用锁定α loop C开放构象。值得注意的是，纳米盘结构中首次观察到α亚基N端1-3位残基（SEH模体）以平面四边形几何构型配位铜离子，该ATCUN模体在Torpedo和牛源结构中均未发现。

脱敏态结构特征

在100 μM和1 mM ACh条件下捕获的脱敏态结构（2.64-2.73 ?）显示：α loop C完全闭合，其αS191与δ/ε loop F形成氢键网络稳定ACh结合。α-ε界面因εD173额外负电荷而更具电负性，而α-δ界面则被δY115等5个芳香族残基空间阻碍。跨膜区（TMD）中，9′亮氨酸门（αL251）旋转使孔径扩大至6 ?，但6′位置βF259仍形成4.2 ?脱敏门控。

构象转变机制

比较静息与脱敏态发现：1）αS266与δE189/εE184的氢键在脱敏态增强，其中α_ε亚基的M2-M3环位移达4 ?，显著大于α_δ的2 ?；2）M2螺旋外倾3°-7°伴随9′亮氨酸旋转；3）β5-β6发夹和MX/MA螺旋的构象变化提示信号从胞外域（ECD）向TMD传递的路径。这些发现与牛源AChR研究一致，但人源结构中αC192-αC193二硫键保持完整，不同于牛源的还原状态。

CMS变异体功能表征

通过电生理分析8个未报道的CMS变异体：

• 快通道型（FCCMS）：αT133I（Cys环）、βI285S（M3螺旋）和δD180N（破坏loop F盐桥）显著缩短通道开放时间（τ=1.05-1.86 ms vs WT 5.61 ms）
• 慢通道型（SCCMS）：αI49T（ECD）意外导致电导降低（33 pS vs WT 63 pS），而αT281S、δL272P（16′孔道）等延长开放时间达69.88 ms
  结构定位显示：73% SCCMS变异集中于TMD，尤其M2螺旋13′（αT254I）和9′（βL262M）形成致病热点，而FCCMS变异在ECD-TMD均匀分布。

亚基组装多样性

冷冻电镜数据意外捕获α₃ε₂和α₂βδ₂两种非经典五聚体。电生理证实αβδ组合可形成功能性通道，其电导介于成年型（α₂βδε）与胎儿型（α₂βδγ）之间，提示神经肌肉接头可能存在更复杂的受体亚型调控。

研究意义与局限

该研究首次建立人源AChR重组表达体系并获得高分辨率结构，不仅阐明CMS变异的分子病理机制，还发现ATCUN模体可能参与金属离子调控。但TMD动态性导致部分配体（如PAM、氟西汀）结合位点未能解析，且αI49T的双重表型机制仍需探索。这些结构数据为开发靶向AChR的精准疗法提供了重要基础。