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在全球气候变化背景下，低温和干旱严重影响牧草产量与品质。研究人员对百脉根（Lotus corniculatus）的 LcC2DPs 蛋白激酶家族展开研究。他们鉴定出 90 个成员，明确其在激素和胁迫响应中的作用。该研究为提升百脉根抗逆性育种提供了基因资源。
全球气候变化使得极端天气愈发频繁，干旱和低温等灾害对生态系统、农业以及牧草生产造成了极大的威胁。想象一下，大片的牧场因干旱而枯萎，牛羊缺乏足够的饲料，这不仅影响了畜牧业的发展，还可能引发一系列生态问题。在植物细胞中，钙依赖蛋白激酶（CDPKs）对植物应对非生物胁迫起着关键作用，然而在优质牧草百脉根（Lotus corniculatus）中，其相关的 C2 结构域蛋白（C2DP）的研究却相对较少。为了深入了解百脉根应对非生物胁迫的机制，挖掘潜在的抗逆基因资源，贵州大学的研究人员开展了关于百脉根 LcC2DPs 蛋白激酶基因家族的研究。
研究人员通过一系列实验和分析，得出了诸多重要结论。他们共鉴定出 90 个 LcC2DPs 基因，这些基因在染色体上呈现出特定的分布模式，部分基因存在串联重复现象。基因结构分析表明，LcC2DPs 基因包含不同数量的外显子和内含子，且其编码的蛋白质具有多样的理化性质和亚细胞定位。通过系统发育分析，发现百脉根与拟南芥的 C2DPs 基因具有相似性，可分为五个亚家族。此外，研究还揭示了 LcC2DPs 基因启动子中含有多种激素和胁迫响应元件，其在不同组织和处理条件下的表达模式存在差异，并且确定了 5 个核心蛋白及与之共表达的转录因子（TFs），这些转录因子在干旱和冷胁迫响应中发挥着重要作用 。该研究为解析百脉根应对非生物胁迫的分子机制提供了重要依据，也为培育抗逆性更强的百脉根品种奠定了理论基础，对促进牧草产业的可持续发展具有重要意义。该研究成果发表在《Scientific Reports》上。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，利用生物信息学工具，基于百脉根数据库中的基因组和蛋白质序列数据，通过隐马尔可夫模型（HMM）等筛选出 LcC2DPs 基因家族成员；其次，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术，检测不同处理条件下 LcC2DPs 基因的表达水平；最后，借助蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络分析和转录因子共表达分析，探究 LcC2DPs 蛋白之间以及与转录因子之间的相互作用关系。
研究结果如下：
- LcC2DPs 家族成员：运用 HMMER、InterPro 和 SMART 软件，从百脉根基因组中成功鉴定出 90 个 LcC2DPs 基因。这些基因编码的蛋白质在氨基酸长度、分子量、等电点、脂肪系数、亲水性和不稳定性指数等方面存在显著差异，且分布于细胞核、细胞质等多种细胞位置。
- Motif、基因结构、内含子和外显子：通过 MEME 软件分析，将 LcC2DPs 家族分为 5 个亚家族，发现 motif1 和 6 最为保守。基因结构显示，LcC2DPs 基因包含 1 - 18 个外显子和 1 - 15 个内含子，外显子数量多于内含子，不同成员的编码序列（CDS）大小差异明显。
- 染色体定位：借助 TBtools 分析发现，LcC2DPs 基因分布在百脉根的 chr0 - chr6 染色体上，其中 chr0 基因数量最多，且存在多个基因串联分布的区域，暗示可能存在基因复制事件。
- 系统进化：通过构建百脉根和拟南芥 C2DPs 蛋白的系统发育树，将其分为五个亚家族，各亚家族成员具有特定的结构域组合，表明两个物种在 C2DPs 基因进化上具有相似性。
- 共线性基因：共线性分析表明，百脉根基因组存在 5 个串联重复基因和 9 对同源基因，且与拟南芥有 34 对同源基因对，显示出较强的系统发育关系。
- 启动子顺式作用元件：对 2000bp 上游序列分析发现，LcC2DPs 基因启动子富含光、生长素、脱落酸等响应元件，以及冷、干旱、缺氧和防御等胁迫调节元件。
- GO 和 KEGG 富集通路：GO 分析显示，LcC2DPs 基因在细胞组分、分子功能和生物过程方面具有多种功能，主要涉及激素响应、激酶活性等。KEGG 富集分析表明，其主要参与物质代谢、泛素系统和基因转录等 13 条通路。
- 基因聚类组：在非生物胁迫下，90 个 LcC2DPs 基因在茎节组织中的表达呈现出上调、下调和无变化三种模式，表明其在细胞胁迫响应中发挥着多样的调节作用。
- 基因表达模式：通过 qRT-PCR 分析发现，10 个 LcC2DPs 基因在根、茎、叶中的表达存在差异，且对 ABA 和 IAA 处理的响应模式不同。在干旱和冷胁迫下，这些基因的表达也发生显著变化，表明它们参与了植物对多种胁迫的响应过程。
- 调控通路：利用 STRING 和 Cytoscape 分析，确定了 LcC2DP5、11、15、38 和 58 这 5 个核心蛋白，它们在 90 个家族成员的调控通路中起主要作用，且均对干旱和低温胁迫有响应。
- 共表达转录因子：通过 Python 脚本分析，发现只有 LcC2DP5 和 LcC2DP15 有共表达转录因子数据，涉及 bZIP、bHLH 等 8 种转录因子家族，这些转录因子在植物非生物胁迫响应中发挥重要作用。
- 转录因子表达：对关键非生物胁迫相关转录因子的 qRT-PCR 分析表明，在干旱和低温胁迫下，不同转录因子的表达模式存在差异，其中 NAC 和 C2H2 在干旱胁迫中起关键作用，bZIP 和 MYB-related 在低温胁迫中至关重要。
研究结论和讨论部分指出，百脉根 LcC2DP 基因家族比水稻、棉花和拟南芥的更大，其基因的结构特征、染色体定位和进化关系表明，基因复制和变异在其家族演化中发挥了重要作用。LcC2DPs 参与植物激素和非生物胁迫响应，通过与转录因子的相互作用，形成复杂的调控网络。未来，还需运用更多技术方法，如基因编辑、酵母杂交等，进一步深入研究和验证这些调控关系，这将有助于更全面地揭示植物应对非生物胁迫的分子机制，为牧草及其他植物的抗逆育种提供更有力的理论支持和基因资源。
