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本文聚焦 RNA 干扰（RNAi）技术，优化 WRAP 基纳米颗粒用于斑马鱼胚胎转染。研究发现添加 20% 聚乙二醇（PEG）的 WRAP1 纳米颗粒效果最佳，经简单浸泡，可实现剂量依赖的 siRNA 内化和高效绿色荧光蛋白（GFP）沉默，为体内基因沉默研究提供新方向。
### 基于 WRAP 的纳米颗粒用于斑马鱼胚胎 siRNA 递送的研究
在生物医学研究领域，治疗性核酸（NAs）作为新一代药物备受关注，其中双链小分子干扰 RNA（siRNA）可通过降解靶 mRNA 沉默基因表达，已有 6 种基于 siRNA 的疗法获 FDA 批准。基因治疗多基于病毒载体，但存在风险，因此非病毒载体成为研究热点，细胞穿透肽（CPPs）便是其中之一。WRAP（色氨酸和精氨酸丰富的两亲性肽）家族能与 siRNA 形成纳米颗粒，在细胞系中展现出高效的 siRNA 递送能力。斑马鱼（
Danio rerio）作为优秀的体内模型，在基因调控研究方面具有诸多优势，但传统的微针注射法存在弊端。本研究旨在优化 WRAP 基纳米颗粒，通过简单的浸泡方法将 siRNA 转染到斑马鱼胚胎中，为相关研究开辟新途径。
实验设计与方法
- 材料准备：WRAP1、WRAP5 及其 PEG 化肽在 SynBio3 平台合成并纯化，不同 siRNA 序列购自 Eurogentec。实验还使用了多种细胞系、抗体及相关试剂。
- 纳米颗粒制备：在含 5% 葡萄糖的纯水中，按肽与 siRNA 摩尔比 20:1 的比例添加肽和 siRNA，室温下制备纳米颗粒。
- 纳米颗粒表征：运用动态光散射（DLS）和 Zeta 电位仪测定纳米颗粒的平均粒径、多分散指数（PdI）和 Zeta 电位，通过琼脂糖凝胶迁移阻滞实验评估纳米颗粒稳定性。
- 细胞实验：将稳定转染 GFP 的 HEK293 细胞培养后，与纳米颗粒孵育，利用 Western blot 检测 GFP 沉默效率，通过乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估细胞毒性。
- 斑马鱼实验：选用Tg[fli1]:EGFPy1转基因斑马鱼，其血管内皮细胞表达 GFP。斑马鱼胚胎去绒毛膜后，在含不同浓度 Cy3 标记 siRNA 的 PEG 化 WRAP1 纳米颗粒溶液中浸泡 24h，之后通过共聚焦显微镜观察 siRNA 内化情况，Western blot 检测 GFP 沉默效果。
实验结果
- GFP 沉默效果评估：在 HEK293 细胞中，使用不同 siRNA（siGFP-M、siGFP-G、siGFP-W）与 WRAP1 或 WRAP5 形成纳米颗粒进行转染。结果显示，所有纳米颗粒在高浓度（60nM）siRNA 时均能显著沉默 GFP 表达，且无明显细胞毒性。不同 WRAP1 纳米颗粒的沉默效果相近，而 WRAP5:siGFP-W 的 GFP knockdown 效果相对较高。
- 纳米颗粒稳定性优化：分析纳米颗粒在不同盐溶液中的稳定性，发现 WRAP1:siRNA 纳米颗粒在稀释后初期稳定，但在 E3 培养基中放置 1 天后不稳定；WRAP5:siRNA 纳米颗粒在盐溶液中易形成大复合物或聚集体。通过 PEGylation 优化，20% PEG-WRAP1:siRNA 纳米颗粒在不同盐溶液及 E3 培养基中放置 1 天后仍保持稳定，且对肝素的耐受性增强。
- 斑马鱼胚胎 siRNA 内化及 GFP 沉默：将斑马鱼胚胎浸泡在含 20% PEG-WRAP1 纳米颗粒的溶液中，观察到 siRNA 呈剂量依赖性内化。通过 Western blot 和共聚焦显微镜检测，发现纳米颗粒能有效沉默 GFP 表达，且沉默效果具有序列特异性。
讨论
本研究成功建立了利用 PEG 化 WRAP1 基纳米颗粒通过浸泡实现斑马鱼胚胎基因沉默的方法。在 HEK293 细胞中验证了不同 siRNA 的沉默效率，为后续斑马鱼实验奠定基础。PEGylation 显著提高了 WRAP1 纳米颗粒在盐溶液中的稳定性，使其适用于斑马鱼胚胎培养环境。斑马鱼胚胎实验表明，该方法可实现 siRNA 的有效内化和 GFP 的高效沉默，且内化途径可能主要是皮肤转位而非口服吸收。
虽然研究取得一定成果，但仍有改进空间。例如，可使用化学修饰的 siRNA 提高 RNAi 沉默效率，进一步优化实验条件以增强转染效果。斑马鱼作为优秀的模型，在基因功能研究、药物研发和毒理学研究等方面具有广阔应用前景。本研究为相关领域提供了新的技术手段，有望推动生命科学和健康医学的发展。
