解锁 EAAT3 底物识别结构密码：探秘神经与代谢疾病的关键转运蛋白

本文聚焦兴奋性氨基酸转运体 3（EAAT3），通过冷冻电镜（cryo-EM）和生物物理方法，解析其底物识别的结构基础。研究发现 L - 半胱氨酸（L-Cys）以硫醇盐形式结合，且 R-2 - 羟基戊二酸（R-2HG）或并非其转运底物，为相关疾病研究提供重要依据。

　　### 研究背景
兴奋性氨基酸转运体（EAATs）属于溶质载体 1（SLC1）家族，能利用离子梯度将底物转运进细胞。人体内有 5 种 EAAT 亚型，各自功能和表达部位不同。其中，EAAT3 在神经元及多种外周组织中表达，它不仅能转运 L - 谷氨酸（L-Glu）、L - 天冬氨酸（L-Asp）和 D - 天冬氨酸（D-Asp），还是唯一能高效转运 L - 半胱氨酸（L-Cys）的亚型。

L-Cys 对神经元意义重大，它是抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）合成的关键前体，能保护神经元免受氧化应激损伤。同时，它还参与生成气体信号分子硫化氢（H₂S），对蛋白质的翻译后修饰有重要作用。一旦 EAAT3 功能出现异常，就可能引发多种神经疾病，比如缺血性中风、癫痫、帕金森病、亨廷顿病和阿尔茨海默病等。此外，EAAT3 在癌症中也扮演着特殊角色，它参与肿瘤细胞的代谢重编程，近期还有研究指出它可能是 “肿瘤代谢物” R-2 - 羟基戊二酸（R-2HG）的转运体。

EAAT3 是同源三聚体，每个原聚体都由中央三聚体支架和外周转运结构域构成。在转运过程中，转运结构域会在细胞外向和细胞内向状态（OFS 和 IFS）之间交替转换，而支架结构域则相对稳定。此前对人 EAAT3 去糖基化突变体（hEAAT3g）的研究发现，在高浓度 Na⁺存在时，该转运体更倾向于 IFS 状态。为了深入探究 EAAT3 识别不同底物的结构基础，研究人员开展了一系列实验。

实验方法

1. 蛋白质表达与纯化：hEAAT3g 和 Cys-mini K269C/W441C hEAAT3g 在悬浮 FreeStyle? 293-F 细胞中表达，经过一系列复杂的步骤进行纯化，包括膜蛋白的溶解、与树脂结合、洗脱、标签切割以及尺寸排阻色谱（SEC）纯化等。纯化后的 Cys-mini K269C/W441C hEAAT3g 与 HgCl₂反应交联，再经 SEC 去除杂质，最后与不同底物孵育用于后续实验。
2. 热稳定性测定：将纯化的 hEAAT3g 稀释、浓缩后，加入不同浓度的底物，在 Tycho NT.6 仪器上进行热稳定性检测。通过记录蛋白质在 330nm 和 350nm 处的荧光变化，计算出蛋白质变性温度的变化，以此判断底物与 hEAAT3g 的结合情况。
3. 蛋白脂质体重构与固体支持膜电生理学（SSME）：制备包含特定脂质的脂质体，使其与纯化的 hEAAT3g 按一定比例混合，再去除洗涤剂形成蛋白脂质体。将蛋白脂质体沉积在传感器上，利用 SURFE2R N1 仪器记录转运相关电流，从而检测底物的转运情况。
4. 冷冻电镜（cryo-EM）样品制备与数据采集：将蛋白样品滴加到特定的网格上，经过 blotting 和 plunge-freezing 处理后，在不同的显微镜下收集冷冻电镜数据。不同底物的样品采集条件有所差异，如放大倍数、像素大小、聚焦值、剂量等都根据实际情况进行调整。
5. 冷冻电镜图像处理与模型构建：对收集到的冷冻电镜数据，使用 MotionCorr2、CtfFfind-4.1 等软件进行处理，通过粒子选择、分类、重构和细化等步骤获得高分辨率的密度图。将已知的蛋白结构模型拟合到密度图中，利用 ChimeraX、COOT 和 Phenix 等软件进行手动调整和精修，最终得到准确的结构模型。

实验结果

1. 纯化的 hEAAT3g 与多种底物的结合和转运：通过热稳定性实验发现，10mM 的 L-Asp、D-Asp 和 L-Glu 能提高 hEAAT3g 的变性温度，而 10mM 的 L-Cys、D-Glu 或 R-2HG 在该浓度下无明显作用。当 L-Cys 浓度提升到 100mM 时，能稳定 hEAAT3g，这表明 L-Cys 在高浓度下可与 hEAAT3g 结合。进一步研究发现，L-Cys 在 pH8.8 时对 hEAAT3g 的稳定作用与 L-Glu 相似，结合 L-Cys 的巯基 pK_a值（8.3），说明 L-Cys 是以硫醇盐形式与 hEAAT3g 结合。在 SSME 实验中，R-2HG 未产生转运电流，而 L-Asp、D-Asp、L-Glu 和 L-Cys 都能产生相应的电流，这表明 R-2HG 无法被 hEAAT3g 转运。
2. hEAAT3-X 与底物结合的结构：对 hEAAT3-X 与不同底物结合的结构进行解析，发现与 L-Asp 结合时，hEAAT3-X 处于 iOFS构象，底物门（螺旋发夹 2，HP2）关闭，L-Asp 结合位点清晰可见；与 R-2HG 结合时，hEAAT3-X 主要处于 OFS 构象，HP2 门大开，底物结合位点为空。与 D-Asp 结合时，hEAAT3-X 也处于 iOFS构象。此外，研究还发现不同底物会影响 hEAAT3-X 转运结构域的分布。
3. L-Cys 结合的 hEAAT3-X 的构象集合：对 L-Cys 结合的 hEAAT3-X 进行冷冻电镜成像，得到的密度图显示转运结构域密度模糊。通过对称性扩展和局部 3D 分类，识别出 OFS、iOFS、iOFS和 IFS 四种不同的结构类。其中，OFS、iOFS 和 iOFS的底物结合口袋中有 L-Cys 密度，而 IFS 中无配体密度，且 HP2 门大开，仅结合 Na⁺离子，这与之前报道的 hEAAT3g 的 IFS 低底物亲和力相符。
4. EAAT3 识别配体的结构基础：iOFS*-Cys 结构显示，L-Cys 与 L-Glu 的配位方式相似，其主链羧酸盐与 N451 和 S333 相互作用，氨基与 D444 相互作用，侧链硫原子与 R447 距离为 2.8?，表明结合的 L-Cys 为硫醇盐形式。对比不同底物结合的 hEAAT3-X 结构发现，R447 侧链在不同底物结合时会发生轻微移动，采取不同的旋转异构体。同时，不同底物的结合姿势也存在细微差异，这表明 EAAT3 通过微调结合口袋中侧链构象和底物结合姿势来识别不同底物。
5. 外向 L-Cys 结合状态下的部分开放门：对 L-Cys 结合的不同状态进行分析，iOFS*-L-Cys 和 iOFS 处于完全结合的封闭状态，HP2 关闭，有 L-Cys 和三个 Na⁺离子结合。而 OFS-L-Cys 中，在底物结合位点和 Na1、Na3 位点有额外密度，但 Na2 位点为空且结构扭曲，HP2 尖端处于中间位置，使得底物结合口袋部分暴露于溶剂中，这种结构特征表明它捕获了在最后一个钠结合到 Na2 位点和 HP2 门关闭之前的中间状态。

研究讨论

1. 底物结合与转运形式：本研究结构和结合实验表明，EAAT3 以硫醇盐形式转运 L-Cys，关键氨基酸 R447 在协调酸性氨基酸和 L-Cys 硫醇盐中起重要作用，它与 D444、N451 共同决定底物特异性。与中性氨基酸转运体 ASCT1 和 ASCT2 对比，R447 的差异影响了对 L-Cys 的转运形式。
2. R-2HG 与 EAAT3 的关系：此前有研究提出 R-2HG 可能通过 EAAT3 进入细胞，但本研究中，高浓度 R-2HG 在多种实验中都未显示出与 hEAAT3g 的有效结合或转运。从结构上看，R-2HG 与 D-Glu 类似，但缺少与 D444 的关键盐桥，且其 γ- 羧基与 T370 和 R447 存在冲突，这都不支持 EAAT3 是 R-2HG 转运体的假设。不过，由于肿瘤中 R-2HG 浓度较高，不能完全排除 EAAT3 以极低亲和力转运 R-2HG 的可能性。
3. L-Cys 转运与细胞功能：L-Cys 在维持细胞氧化还原状态等方面至关重要，不同转运体对 L-Cys 的转运能力存在差异。EAAT3 是神经元中主要的 L-Cys 转运体，但其对 L-Cys 的亲和力与其他转运体不同的原因可能与结合位点外的变构效应有关。
4. 转运过程的中间状态：动力学研究表明 EAATs 的底物和离子结合存在部分结合的中间状态，本研究中 OFS-L-Cys 的结构特征可能直接可视化了这种低亲和力结合中间状态。
5. 底物对转运体构象的影响：不同底物会使转运体呈现不同的构象偏好，这表明转运体在运输循环中的相对能量状态可能依赖于底物，进而推测转运体可能具有底物依赖性的转运速率。

综上所述，本研究通过多种实验方法深入探究了 EAAT3 的底物识别结构基础，为理解其在神经和代谢相关疾病中的作用提供了重要的结构依据，也为后续相关研究指明了方向。