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本文介绍在临床诊断实验室实施 ISO 15189 认可的血浆游离总核酸（cfTNA）二代测序（NGS）服务。通过评估相关指标验证方法性能，实现快速检测，对癌症诊疗意义重大，为临床诊断提供新路径。
引言
分子病理学技术，尤其是二代测序（NGS）技术，在癌症个性化医疗中至关重要。多基因 NGS 检测已成为肿瘤样本靶向分析的首选方法。在晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，部分患者存在可靶向治疗的致癌驱动基因改变，但约 25% 的患者无法获取组织进行传统检测。液体活检通过外周血采样可实现基因组分析，弥补组织活检的不足。同时，NSCLC 患者疾病进展时，全面分子分析对后续治疗决策至关重要，而液体活检能更好地应对肿瘤异质性问题。此前研究虽对比了传统组织和液体活检，但本研究首次评估了 Ion Torrent Genexus 系统全自动 cfTNA NGS 工作流程在临床诊断实验室的性能。
目标
本研究旨在优化血浆测序的方法和自动化平台，建立血浆 /cfTNA NGS 结果 5 天的周转时间（TAT），并获得血浆 /cfTNA 检测的 ISO 15189 认可（INAB ISO15189:2012）。Ion Torrent Genexus 此前已获 ISO 15189 认可用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织检测，且可用于血浆 cfTNA 检测，操作简便，核酸起始量低。在临床诊断分子实验室优化新技术时，需遵循相关指南和建议，进行临床验证和认可。
材料和方法
- 样本选择和采集：研究使用了 60 个样本，包括 29 个真实世界的 NSCLC 样本、20 个商业参考材料和 11 个外部质量评估（EQA）熟练度测试样本。采集 10 - 16 mL 血液于 K2/K3 EDTA 管或 Roche cfDNA 管，样本采集后需及时离心分离血浆并储存于 - 80°C。Roche cfDNA 管样本不适用于长期（>30 天） - 80°C 储存，故其结果未用于对比分析。商业参考材料和 EQA 样本用于评估检测性能。
- 样本制备：按照制造商说明进行仪器外预处理，加入蛋白酶 K 后进行核酸提取，耗时约 30 分钟。提取和纯化步骤在 Genexus Purification Instrument（GPI）上自动化完成，内置 Qubit 用于荧光定量。定量后的 TNA（最低 5 ng 核酸输入）转移至 Genexus 板和测序仪。
- 文库制备、测序和数据分析：主要验证和评估 Oncomine Precision Assay（OPA），同时验证 Oncomine Dx Express test（ODxET）作为正交检测。这些泛癌靶向面板涵盖约 50 个关键基因的多种变异类型。
- 报告：使用 Oncomine Reporter（OR）软件（V.5.8）对 NGS 数据进行下游分析并生成报告，每月更新软件以跟进相关指南和临床试验变化。变异调用文件上传至 OR 软件，报告需经病理顾问授权。
- TAT 测量：TAT 指从请求到生成完整分子报告（经病理顾问授权，结果可在电子病历中查看）的时间，以工作日计算。
- ISO 15189 认可：向爱尔兰国家认可委员会（INAB）申请将血浆 cfTNA 样本的 NGS 服务纳入年度认可评估计划，验证后接受外部机构审核。
- 分析验证：为 OPA 建立实验室特定性能指标，评估各变异类型的阳性百分比一致性（PPA）和阳性预测值（PPV），包括分析灵敏度、特异性、检测限（LOD）等。
- 质量性能指标的建立：根据 NGS 面板验证指南，基于 60 次检测结果建立测试性能特征，确定各性能指标的最低阈值用于持续质量控制。
结果
- 核酸提取和定量：验证 GPI cfTNA 方案时，对 29 个真实世界血浆样本和 31 个商业 / EQA 材料进行 TNA 提取、纯化和定量，部分样本虽 TNA 输入量低于制造商建议阈值（0.33 ng/μL，即 5 ng TNA），但仍成功测序并检测到变异。
- 测序性能：根据优化过程中建立的性能指标判断运行是否成功，如 DNA 文库的比对读数应在 800 - 1200 万读数 / 样本，变异等位基因分数也为重要指标。
- OPA 性能：变异检测准确性：验证针对 NSCLC 患者的检测时，对 11 个可报告或一级 / 可操作变异进行验证。EDTA 管样本与正交方法一致性更高，Roche cfDNA 管样本因长期储存问题被排除对比分析。总体与正交方法的一致性为 83%，存在部分样本组织活检变异未在血浆中检测到的情况。经检查，未发现变异检测受同聚物区域或位置效应影响。
- OPA 分析重复性、灵敏度和特异性：通过正确识别无目标变异样本评估小 DNA 变异的分析特异性，不同操作员、试剂和芯片多次检测对照材料，结果一致，重复性良好。虽真实世界样本限制了融合分析，但对标准化参考对照的 RNA 融合检测灵敏度达 100%，特异性良好。稀释研究确定检测限（LOD）为 1.2%（深度覆盖 22000× 时）。
- NGS 结果周转时间：内部实施 6 个月后审计显示，血浆 cfTNA NGS 检测 TAT 为 5 天，相比外包参考实验室的 > 15 个工作日大幅缩短，减少了 68%。
- 认可：经 INAB 审核，成功获得 ISO 15189 认可。
讨论
本研究在 6 个月内建立了 ISO 15189 认可的血浆 /cfTNA NGS 检测服务，并缩短了 TAT。全集成工作流程减少了人工操作时间，Genexus 快速测序技术提升了检测速度。虽检测一致性为 83%，但存在部分组织活检变异未在血浆中检测到的情况，可能因血液中肿瘤遗传物质丰度低。可通过确定肿瘤分数（ctDNA 占总 cfDNA 的比例）改进检测。本研究还强调了标准化预分析方案的重要性，不同采血管对样本稳定性和处理要求不同。研究局限性在于真实世界临床样本量相对较小，未来研究应增加融合基因检测样本量，并进一步验证拷贝数变异（CNV）分析。
结论
FFPE 肿瘤活检是精准医疗的标准，但结合组织和血液样本检测能更全面了解肿瘤基因突变。Genexus 上的全自动 cfTNA 检测经济高效，有助于癌症预后评估和个性化治疗，推动癌症诊疗发展，合理利用医疗资源，改善癌症患者预后。
