基于LuxI/R群体感应系统的新型枯草芽孢杆菌自诱导胞外表达系统开发与优化

推荐语：本研究针对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中外源LuxI/R型群体感应(QS)系统自诱导表达效率低的问题，通过工程化改造感应模块启动子SPluxI核心区(-10/-35元件)、关键区(UP元件和间隔区)及响应模块启动子RPluxIR6的lux box拷贝数，构建出高表达Sc-R2系统。摇瓶和3-L发酵罐实验表明，该系统使胞外淀粉酶活性较原始系统(SO-R0)提升2.7-3.1倍，且对果聚糖蔗糖酶和蔗糖酶等报告蛋白具有普适性，为合成生物学提供了高效的微生物表达平台。

　　

在微生物合成生物学领域，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)因其卓越的蛋白分泌能力和GRAS(公认安全)特性，已成为重要的工业微生物底盘。然而，当前该菌株的诱导表达系统主要依赖外源添加诱导剂或内源性ComQXPA群体感应(QS)系统，前者增加生产成本，后者易受细胞生理过程干扰。来自安徽大学的研究团队在《Microbial Cell Factories》发表研究，通过改造费氏弧菌(Vibrio fischeri)的LuxI/R型QS系统，成功开发出高效自诱导胞外表达系统。

研究采用启动子工程策略，结合摇瓶发酵、3-L发酵罐放大实验和qRT-PCR技术。通过定向进化构建RPluxIR6突变库，采用淀粉平板透明圈法高通量筛选；利用POE-PCR技术组装质粒，以淀粉酶AmyZ1为报告蛋白评估系统性能，并拓展验证果聚糖蔗糖酶BhLS 39和蔗糖酶InvDz13的普适性。

【Development of a LuxI/R device-based autoinducible extracellular expression system】
研究首先构建包含luxI-luxR感应模块和RPluxIR6-amyZ1响应模块的pBLA载体，发现其自诱导表达效率仅为组成型启动子P_veg的88%。时序分析显示，LuxI/R系统能有效缓解细胞生长与产物合成的资源竞争。

【Engineering the-10 and-35 regions of SPluxI】
将SPluxI的-10区替换为P₄₃、P_spoVG序列，-35区替换为P_ylB序列后，突变体SPluxI-4310spoVG35使淀粉酶活性提升1.83倍。qRT-PCR证实该改造通过增强luxI转录，提高信号分子AHL浓度，进而激活RPluxIR6。

【Engineering the UP region of SPluxI-4310spoVG35】
插入含AGC序列的UP3元件后，SPluxI-UP3-4310spoVG35的酶活达295 U/mL，较原始启动子提升2.6倍。研究发现UP区通过结合RNAP的α-CTD结构域促进转录起始复合物形成。

【Engineering the lux box of RPluxIR6-GA】
在响应模块中增加lux box拷贝数构建的R2系统，使Sc-R2组合的淀粉酶活性达346 U/mL。但lux box超过双拷贝时会产生空间位阻，反抑制RNAP结合效率。

【Generalizability and scale-up fermentation】
3-L发酵罐中Sc-R2系统使淀粉酶产量达5814.67 U/mL，较P_veg提升3.07倍。该系统对BhLS 39和InvDz13的表达同样具有2.6倍增强效果，证实其工业应用潜力。

该研究首次通过协同优化LuxI/R系统的感应/响应模块启动子，建立了枯草芽孢杆菌高效自诱导表达平台。其创新性体现在：揭示UP区AGC序列对转录激活的关键作用；发现lux box拷贝数存在最优阈值；实现了从摇瓶到发酵罐的稳定放大。该系统为工业酶制剂的低成本生产提供了新策略，并为QS系统在合成生物学中的应用拓展了设计范式。未来可通过优化LuxR蛋白表达进一步提高系统性能。