超长互补决定区天然抗体的稳定性趋同机制及其生物医学应用潜力

在抗体研究领域，牛源抗体中部分具有超长互补决定区（ulCDR），其结构和稳定性维持机制尚不明确。研究人员通过交换不同天然 ulCDR 构建变体，发现变体间热稳定性相似、抗原结合保留且结构指纹变化小。这揭示了抗体结构稳定性原理，为生物医学应用提供思路。

　　在生物医学的抗体研究领域，传统抗体由两条重链（HC）和两条轻链（LC）组成独特的 Y 型结构，其抗原结合特异性由互补决定区（CDR）赋予 。然而，多数常规抗体的 CDR 长度有限，如人 CDR-H₃通常仅含 6 - 20 个氨基酸。与之形成鲜明对比的是，部分牛源抗体拥有超长的 CDR-H₃（ulCDR），长度可达 70 个氨基酸，折叠成柄和结的迷你结构域。其中，结区负责抗原结合，柄区则连接结区与抗体框架，对抗体稳定性至关重要。但目前，这些抗体维持结构和稳定性的基本原理仍扑朔迷离，不同天然 ulCDR 与同一 Fab 支架的兼容性也有待探究。

为了解开这些谜团，来自根特大学（Ghent University）、马里博尔大学（University of Maribor）、达姆施塔特工业大学（Technical University of Darmstadt）等机构的研究人员开展了深入研究。他们通过将不同的天然 ulCDR 交换到同一牛源 Fab 支架上，构建了多种变体。研究发现，尽管这些变体的 ulCDR 差异很大，但它们的热稳定性却惊人地相似，Fab 的二级结构指纹也基本保持一致。同时，交换 ulCDR 后的变体仍能保持对目标抗原的高亲和力结合。这一研究成果发表在《Communications Biology》上，为抗体设计在生物医学领域的应用提供了重要的理论基础。

研究人员在本次研究中主要运用了以下关键技术方法：首先，通过蛋白质表达技术获取带有不同 ulCDR 的 Fab 片段及相关抗原；其次，运用多种生物物理技术，如差示扫描荧光法（DSF）、动态光散射（DLS）、尺寸排阻色谱 - 多角度光散射联用技术（SEC - MALS），对 Fab 变体的稳定性和分子质量等进行表征；再者，采用生物层干涉技术（BLI）测定 Fab 片段与抗原的结合亲和力；此外，利用圆二色谱（CD）、微流控调制光谱（MMS）和核磁共振（NMR）技术分析抗体的结构；最后，借助氢氘交换质谱（HDX - MS）和分子动力学模拟（MD）探究抗体结构动力学差异。

下面来详细看看具体的研究结果：

• Fab 变体热稳定性趋同：研究人员挑选了 7 种序列同源性低、性质各异的天然超长 CDR，将其分别替换模型牛源 Fab（NC - Cow1 wt）中的 ulCDR，构建了 6 种变体，并设置了一个截短变体（Δknob）。通过 DSF 分析发现，这些变体的解链转变温度范围较窄，表观解链温度（TM）在 66 - 70℃之间；DLS 测量显示，各变体的表观流体力学半径（Rh）接近理论值，加热过程中的聚集起始温度（Tagg）也相近。这表明不同的天然 ulCDR 对 Fab 变体的热稳定性影响较小。此外，研究人员还制备了部分变体的亲本 Fab 进行对比，结果发现 Fab 支架本身对整体稳定性的影响比不同天然 ulCDR 的交换更大。
• ulCDR 交换后抗原结合保留：利用 BLI 技术检测发现，6 种交换 ulCDR 的 Fab 变体均能以纳摩尔亲和力与相应抗原结合，而 Δknob 变体则失去了抗原结合能力。通过 SEC - MALS 分析 Fab - 抗原复合物的化学计量比，发现不同变体与抗原的结合模式存在差异，但这些差异并非由 ulCDR 交换导致，而是与变体本身的特性有关。
• ulCDR 交换后 Fab 二级结构指纹保留：通过远紫外圆二色谱（FUV - CD）和 MMS 分析，发现不同变体的二级结构指纹几乎相同，表明 ulCDR 交换对抗体整体结构指纹影响较小。近紫外圆二色谱（near - UV CD）和 NMR 分析显示，变体间存在一些细微的光谱差异，主要源于 ulCDR 中芳香族残基和二硫键的变化，但整体结构指纹仍高度相关。
• 柄区与周围 CDR 环的结构一致性对稳定性重要：HDX - MS 分析发现，与 Δknob 相比，var4 在与柄区相互作用的区域有明显的氘摄取增加，表明该区域的结构稳定性降低。MD 模拟结果也证实，var4 和 var5 柄区的变化导致其与周围区域的相互作用减弱，界面柔性增加。不过，这些细微差异对 Fab 变体的热稳定性影响较小。

综合上述研究结果，研究人员得出结论：天然 ulCDR 可替换 Fab 支架上的原有 ulCDR，且对 Fab 的热稳定性和整体二级结构影响极小，同时能保留高亲和力抗原结合能力。这一发现揭示了含 ulCDR 抗体的基本结构原则，强调了保守轻链在维持抗体稳定性中的关键作用。

在讨论部分，研究人员指出，牛源抗体中独特的 ulCDR 结构拓展了人们对抗体可变区进化和结构多样性的认识。尽管不同 ulCDR 在柄区存在差异，但它们与同一 Fab 支架具有良好的兼容性。这一特性使得在生物医学应用中，可利用不同的天然 ulCDR 构建具有不同抗原特异性的抗体，且能保证其稳定性和结合能力。此外，研究中发现的部分 Fab 变体与抗原结合异常的现象，为进一步探究抗体 - 抗原相互作用机制提供了方向。总之，该研究为抗体在抗病毒、抗癌和免疫调节等生物医学领域的设计和应用奠定了坚实基础，具有重要的理论和实践意义。