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在早期分泌途径中，内质网（ER）与高尔基体之间的物质运输存在未解之谜。研究人员围绕 Trk 融合基因（TFG）开展研究，发现 TFG 可形成空心凝聚物，能分隔顺行和逆行运输载体，这有助于理解早期分泌途径的调控机制。
在细胞的生命活动中，早期分泌途径就像一条繁忙的 “物流通道”，负责将内质网（ER）中合成的蛋白质等货物运输到高尔基体进行进一步加工和分选。然而，这条 “通道” 中存在一些令人困惑的问题。内质网和高尔基体形成的近球形界面，直径小于 500nm，在这个狭小的空间里，顺行（从内质网到高尔基体）和逆行（从高尔基体回到内质网）的运输载体频繁穿梭，却不会发生混乱，它们是如何做到有序运输的呢？而且，之前的研究虽然发现了一些相关蛋白质，但对于它们具体的作用机制仍不清楚。为了解开这些谜团，来自美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校等机构的研究人员开展了深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，通过转染不同的质粒来过表达或干扰相关基因，如利用 CRISPR/Cas9 技术对内源 TFG 基因进行标记；运用多种显微镜技术，包括常规显微镜（宽场 / 去卷积、共聚焦）、超分辨率显微镜（STED、3D-SIM）等，来观察细胞内 TFG 的定位和凝聚物的形态。在体外实验中，纯化重组 TFG 蛋白，研究其在不同条件下的凝聚特性 ，还使用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）对 TFG 凝聚物的结构进行分析。
重组 TFG 在体外组装成各向异性的空心凝聚物
研究人员为探究 TFG 是否参与内质网 - 高尔基体界面的结构构建和运输调控，首先利用微管解聚剂 nocodazole 处理细胞，使高尔基体 “丝带” 结构解聚，便于观察单个内质网出口位点（ERES）与高尔基体对之间的情况。通过共转染实验发现，TFG 定位于 ERES 和高尔基体顺面之间，而 Sec16 主要局限于 ERES 膜上。接着，研究人员从人悬浮细胞中纯化出高纯度（>95%）的重组 TFG，通过液滴蒸发浓缩蛋白质，观察到 TFG 发生相分离，形成具有各向异性结构的凝聚物，内部有～500nm 的空隙，与细胞内过表达时形成的凝聚物结构相似。添加拥挤剂聚乙二醇（PEG）后，TFG 能快速形成尺寸分布广泛的凝聚物，其中亚微米级的凝聚物中心有空隙，类似空心球，其尺寸与内质网 - 高尔基体界面相近。而且，TFG 在生理浓度（~100nM）下就能形成凝聚物，这表明 TFG 在生理条件下具备形成凝聚物的能力。通过 RUSH 系统实验发现，沉默 TFG 会显著降低货物从内质网的清除速率，影响细胞生长，这进一步证实了 TFG 在控制内质网货物运输中的重要性。
内源性标记和过表达证实 TFG 组装成各向异性凝聚物
为了验证体外观察到的 TFG 空心凝聚物在细胞内生理浓度下也存在，研究人员利用 CRISPR/Cas9 技术在 HeLa 细胞中对内源 TFG 进行 C 末端标记。活细胞显微镜观察发现，细胞内存在离散的 TFG 凝聚物焦点，且分布呈各向异性，与体外结果一致，其平均直径也与体外相近。对体内 TFG 凝聚物进行光漂白实验（FRAP），发现荧光恢复程度较低，说明 TFG 在凝聚物中的流动性较差。进一步过表达 TFG 时，TFG 最初分散在细胞质中，随后逐渐凝聚成动态的亚微米级焦点，并融合形成更大的结构。超分辨率显微镜观察显示，TFG 凝聚物表面不光滑，呈海绵状，内部空隙直径与内质网 - 高尔基体界面相似。FRAP 实验还表明，TFG 在凝聚物中的扩散受限，微米级 TFG 凝聚物在融合时会形成 “毛细管桥”，融合后恢复球形，这表明凝聚物具有表面张力和柔性。
TFG 凝聚受磷酸化调控
早期分泌途径中的多种蛋白质受磷酸化调控，TFG 含有多个潜在的磷酸化位点。研究人员发现，在有丝分裂期，内源性标记的 TFG 凝聚物消失，在细胞质中呈分散分布，体外实验也得到类似结果，即从有丝分裂细胞中纯化的重组 TFG 无法形成凝聚物。用 λ 蛋白磷酸酶处理有丝分裂期来源的 TFG 后，其相分离能力恢复，能够组装成各向异性凝聚物。过表达模拟磷酸化的 TFG 构建体时，TFG 无法形成凝聚物，这表明磷酸化导致的分子间排斥足以抑制 TFG 凝聚。通过 Phos-tag 凝胶和蛋白质免疫印迹分析发现，TFG 在整个细胞周期中均发生磷酸化，有丝分裂期处于高磷酸化状态。质谱分析鉴定出多个磷酸化位点，其中 T87 是有丝分裂特异性磷酸化位点。过表达野生型 TFG 和模拟磷酸化的 TFG - T87E 突变体，在有丝分裂期凝聚物会解体，而过表达磷酸化缺陷型 TFG - T87A 突变体在有丝分裂期凝聚物不能完全溶解，这进一步证实了磷酸化在调控 TFG 凝聚物中的作用。
疏水 “粘性” 残基控制 TFG 的各向异性凝聚机制
TFG 大部分是内在无序的，研究人员纯化了 TFG 的不同片段，发现除了折叠部分（TFG1 - 123）外，内在无序部分的片段均能形成各向异性空心凝聚物。通过筛选不同浓度的拥挤剂和盐，发现增加盐浓度促进 TFG 凝聚，表明疏水残基在凝聚过程中起重要作用。TFG 的内在无序区域含有间隔特殊的疏水残基，符合 “粘性残基和间隔残基” 模型，去除这些疏水 “粘性” 残基后，TFG 在体内无法形成凝聚物。温度实验表明，温度影响 TFG 凝聚物的形成和解聚，在 30°C 以下凝聚物会解体，40°C 时凝聚物会融合，且温度变化会改变凝聚物的形状。此外，过表达 TFG 会减少内源性 ERES 并导致高尔基体丝带解体，而删除 “粘性” 残基则不会出现这种情况，共过表达野生型和缺失 “粘性” 残基的 TFG 时，TFG 凝聚物会随着缺失 “粘性” 残基的 TFG 浓度增加而减少，这表明 TFG 的同源相互作用依赖于疏水 “粘性” 残基。
空心 TFG 凝聚物是多孔的，对特定大小的大分子具有选择性
扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）分析显示，TFG 凝聚物表面有不规则的、小于 10nm 的孔状开口。用不同大小的荧光葡聚糖与 TFG 凝聚物孵育实验表明，小于 250kDa 的葡聚糖能进入凝聚物内部，而大于该分子量的则被排斥，去除疏水 “粘性” 残基后，凝聚物失去这种选择性。此外，一段编码两亲性 α 螺旋的区域虽不影响凝聚物的形成、孔径大小和对葡聚糖的选择性，但能提高凝聚物产量并减少硬化，说明其在稳定 TFG 分子间的侧向相互作用中起作用。
TFG 凝聚物可能隔离 COPII 与 COPI 包膜
由于 250kDa 的大小限制与排除核糖体的现象相关，研究人员发现核糖体不能进入 TFG 凝聚物内部。对 TFG 沉默细胞的透射电镜分析显示，内质网 - 高尔基体界面的囊泡数量显著增加，高尔基体膜严重受损。在体外实验中，TFG 凝聚物能够选择性地允许顺行运输所需的 COPII 包膜（由小于 250kDa 的异二聚体组成）进入，而逆行运输所需的 COPI 包膜（七聚体复合物，大于 500kDa）被排除在外。过表达 TFG 诱导形成微米级凝聚物，共转染实验表明，COPII 蛋白 Sec23、Sec24 或其异二聚体 Sec23/24 能进入 TFG 凝聚物，且 Sec23/24 在凝聚物边界富集，而 COPI 包膜始终被排除在 TFG 凝聚物之外。
综上所述，研究人员发现 TFG 能自组织形成 300nm 的各向异性空心凝聚物，作为 ERES 的胞质延伸，构建和控制内质网 - 高尔基体界面的结构和尺寸，在有丝分裂期受磷酸化调控而解体。TFG 凝聚物的多孔结构和对大分子的选择性，使其能够隔离顺行和逆行运输载体，创建一个扩散受限的空间，促进早期分泌途径的高效运输。这些发现为理解早期分泌途径的组织和功能提供了新的视角，揭示了蛋白质凝聚物在细胞内膜运输中的关键作用，有助于深入研究细胞内物质运输的分子机制，对相关疾病的研究也具有重要意义，为后续探索细胞生理过程和疾病发生机制奠定了基础。
