构建 PhrC-RapC-SinR 群体感应分子开关：动态调控枯草芽孢杆菌中维生素 K2（MK-7）合成的创新突破

为解决枯草芽孢杆菌中 MK-7 合成受旁路途径竞争限制的问题，研究人员开展构建 PhrC-RapC-SinR 群体感应（QS）系统调控 MK-7 合成的研究。结果使 MK-7 产量提高 6.27 倍，该研究为代谢工程提供新策略，有重要应用潜力。

　　在生命的奇妙微观世界里，有一种物质正逐渐走进人们的视野，它就是维生素 K 家族中的重要成员 —— 维生素 K₂（menaquinone-7，MK-7）。MK-7 不仅有着出色的生物利用度和较长的半衰期，还在预防心血管疾病、骨质疏松，甚至在癌症、阿尔茨海默病和帕金森病的治疗方面展现出了令人期待的潜力。随着全球老龄化的加剧，这些与年龄相关的疾病发病率逐年攀升，给医疗系统带来了巨大压力。在缺乏有效根治手段的当下，预防成为了关键，这也使得 MK-7 的研究变得愈发重要，其市场前景广阔，吸引着众多科研人员投身于相关研究之中。

在众多用于生产 MK-7 的微生物中，枯草芽孢杆菌 168（Bacillus subtilis 168，BS168）凭借其被美国食品药品监督管理局（FDA）授予的 “公认安全”（GRAS）地位，以及清晰的 MK-7 生物合成途径等优势，成为了生产 MK-7 的热门菌株。然而，研究人员在提升 MK-7 产量的道路上却困难重重。MK-7 的代谢合成途径漫长，且存在众多旁路途径与它竞争前体物质。例如，旁路途径会产生苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）、叶酸、二羟基苯甲酸、羟基丁酮等副产物，这些副产物对于细胞生长不可或缺。以往采用敲除旁路途径相关基因的传统静态代谢工程方法，虽然能在一定程度上减少竞争，但却严重限制了细胞生长，导致 MK-7 合成的增加十分有限。

为了突破这一困境，安徽工程大学的研究人员展开了一项极具创新性的研究。他们致力于构建一种 PhrC-RapC-SinR 群体感应（quorum sensing，QS）分子开关，以此来动态调控 MK-7 的合成。经过一系列艰苦的研究工作，研究人员成功构建了该 QS 系统，并实现了对 MK-7 合成旁路途径的动态调控。最终，MK-7 的产量大幅提高，从最初的 13.95mg/L 提升到了 87.52mg/L，足足增加了 6.27 倍。这一成果意义非凡，它为工业生产 MK-7 提供了新的有效策略，同时也为其他微生物的基因表达调控和代谢产物生产优化开辟了新的思路，在生物技术领域有着巨大的应用潜力。该研究成果发表在了《Microbial Cell Factories》杂志上。

研究人员在开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。在菌株构建方面，利用化学感受态细胞转化技术对枯草芽孢杆菌 168 进行改造，构建出一系列突变菌株。通过重叠延伸 PCR（OEPCR）技术生成诱变 DNA 片段，用于后续的基因工程操作。采用荧光检测技术，以绿色荧光蛋白（eGFP）为报告基因，通过测量相对荧光强度来评估启动子活性和基因表达水平。使用高效液相色谱（HPLC）技术对 MK-7 进行提取和测定，从而准确分析其产量。

下面让我们深入了解一下具体的研究结果：

1. MK-7 生物合成途径分析：研究人员详细剖析了枯草芽孢杆菌中 MK-7 的生物合成途径，发现它由甘油代谢、莽草酸（SA）途径、甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径和 MK 途径四个模块组成。同时，该途径存在多条副产物代谢途径，它们与 MK-7 竞争前体物质，如分支酸（CHA）会被转化为苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、叶酸等，这些副产物还会通过反馈抑制影响 MK-7 的合成。为探究旁路途径对 MK-7 合成的影响，研究人员敲除了关键酶基因，构建了六个突变菌株（BS01 - BS06）。然而，实验结果却出乎意料，这些突变菌株的 MK-7 产量和生物量均显著低于野生型菌株。这表明简单敲除旁路途径基因会破坏细胞的基本代谢过程，凸显了代谢网络的复杂性，也为后续研究指明了方向 —— 需要寻找更精细的调控方法123。
2. SinR 靶向启动子的筛选与优化：SinR 作为一种关键的转录因子，能够与特定的启动子序列结合，抑制下游基因的表达。研究人员计划利用这一特性，用 SinR 响应启动子替换参与副产物合成的基因的天然启动子，从而在 MK-7 发酵阶段下调这些基因的转录。为此，他们构建了 eGFP 报告系统，筛选出了受 SinR 直接调控的启动子。通过对不同启动子 - eGFP 融合菌株进行相对荧光强度分析，发现 SinR 对 P_tapA、P_epsA和 P_slrR等启动子具有显著的抑制作用。其中，SinR 对 P_epsA的调控效率最高，因此对 P_epsA进行了进一步优化。研究人员对 P_epsA的 SinR 结合基序和核心启动子区域进行突变，构建了一系列启动子变体。经过筛选，最终确定 P_e9为最优启动子，SinR 对其抑制效果最强456。
3. PhrC-RapC-SinR QS 系统的构建：RapC 能够通过 ComA 抑制 SinR 的活性，而 PhrC 则可以通过抑制 RapC 来刺激 ComA 依赖基因的表达。研究人员通过实验验证了这一调控关系。他们构建了一系列菌株，如 BP01、BP02 等，通过添加 IPTG 诱导基因表达，观察 eGFP 荧光强度的变化。结果表明，RapC 表达可抑制 SinR 活性，而 PhrC 表达能缓解 RapC 对 SinR 的抑制作用，但无法完全恢复 SinR 的活性。此外，研究人员构建的 PhrC-RapC-SinR QS 系统表现出细胞密度依赖的调控特性，在低细胞密度时，能正常转录目标基因；随着细胞密度增加，该系统会抑制目标基因转录，说明它可作为一种细胞密度响应的遗传开关789。
4. 利用 PhrC-RapC-SinR QS 系统动态微调枯草芽孢杆菌中 MK-7 的合成：研究发现 MK-7 的合成与细菌生物量密切相关，在细菌生长早期，MK-7 合成较慢，随着生物量增加，合成速度加快。基于此，研究人员利用 PhrC-RapC-SinR QS 系统，对参与 SA 途径和相关代谢网络的关键基因表达进行微调。他们将不同强度的启动子替换 aroA 的天然启动子，发现携带 P_e11的菌株 BW1 的 MK-7 产量最高。在此基础上，进一步构建了重组菌株 BW2 - BW5，结果显示当用 P_e9表达 aroH、trpE 和 dhbB 时，MK-7 产量逐渐增加；但用 P_e9替换 alsS - alsD 的启动子后，产量下降。为解决这一问题，研究人员又替换了启动子，最终得到菌株 BW7，其 MK-7 产量达到 87.52mg/L，相比对照菌株 BS168 提高了 6.27 倍。且 BW7 生长速度更快，稳定期更长，有利于 MK-7 的积累101112。

综合上述研究，研究人员成功构建了 PhrC-RapC-SinR QS 系统，并将其应用于枯草芽孢杆菌中 MK-7 合成的动态调控。通过优化 SinR 靶向启动子，精确控制了参与副产物合成途径的基因表达，实现了细胞生长和 MK-7 生产的最佳平衡。这一研究成果不仅显著提高了 MK-7 的产量，还为代谢工程提供了一个通用的平台。PhrC-RapC-SinR QS 系统有望在未来被广泛应用于各种生物技术过程，精确调控复杂的代谢网络，优化产物产量，为生命科学和生物技术领域的发展带来新的契机，推动相关产业的进步。