电子转移工程改造人工设计细胞工厂实现甾体化合物的高效全合成

《Nature Communications》：

为解决甾体生物合成中NADPH依赖型酶电子传递机制不明确、效率低下的问题，江南大学周景文团队通过解析7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)和P450侧链裂解酶(P450scc)的电子传递网络，系统性改造了酿酒酵母的电子传递链。研究通过分步工程化电子传递残基、优化辅因子再生途径，使胆固醇(1.78 g/L)和孕烯醇酮(0.83 g/L)产量显著提升，为甾体药物合成提供了新范式。该成果发表于《Nature Communications》。

　　

甾体药物合成的电子革命：改造细胞工厂的“电流”系统
甾体化合物作为临床上治疗炎症、癌症和激素紊乱的核心药物，其生物合成途径中存在大量依赖NADPH的氧化还原反应。然而，电子从辅因子NADPH到催化中心的传递过程犹如“电流传输不稳定”的电路，存在三大瓶颈：一是DHCR7等关键酶内部电子传递残基作用机制不明；二是P450scc等酶促反应依赖质子耦合电子转移(PCET)，但酸性胞内环境阻碍质子传递；三是传统代谢工程难以协调多步电子传递链的协同优化。这些问题导致甾体合成效率低下，限制工业化应用。

江南大学研究人员选择胆固醇和孕烯醇酮这两种典型甾体作为模式产物，在酿酒酵母中展开电子转移工程(ETE)系统性研究。通过AlphaFold2蛋白质结构预测、分子对接和量子力学/分子力学(QM/MM)计算解析酶机制；采用分子动力学(MD)模拟优化电子传递路径；结合基因编辑技术构建多拷贝整合菌株；利用5-L生物反应器进行发酵验证。

DHCR7电子传递链的“短路”改造
研究首先锁定胆固醇合成限速酶——牛源DHCR7。通过分子模拟发现其电子传递链长达29.4?，包含Y55-F56-F430-F434-Y317五个芳香残基。实验证实突变Y317A会使酶完全失活，而F430Y突变可新增催化位点，使电子传递链缩短68%至9.5?。QM/MM计算显示，改造后的双催化中心(Y317/Y430)通过质子耦合电子转移机制，将C7=C8双键还原能垒从21.4 kcal/mol降至18.9 kcal/mol，最终使胆固醇产量提升5.93倍至191 mg/L。

P450scc的“质子泵”工程
针对孕烯醇酮合成的关键酶——地黄源CYP87A3，研究发现其侧链裂解需Y105残基夺取C22-OH质子。通过引入酸性残基突变A281D-T285E，在活性中心构建“质子泵”，使质子转移能垒从13.5 kcal/mol降至11.1 kcal/mol。MD模拟显示突变体使底物C22与血红素铁距离从2.7?缩短至1.8?，最终产量提升至243 mg/L。

细胞工厂的“电路系统”升级
在底盘改造中，研究整合了人源ADR-ADX电子传递系统，使NADPH/NADP⁺比值从0.3提升至0.8；通过连接肽(GGGGS)缩短CYP87A3与还原酶ATR的物理距离，使孕烯醇酮产量再增37%。最终在5-L发酵罐中，胆固醇和孕烯醇酮产量分别达1.78 g/L和0.83 g/L，创下报道最高水平。

该研究首次从原子层面解析了甾体合成酶的电子传递机制，开创了“电子传递残基-辅因子再生-细胞器定位”三位一体的ETE策略。不仅为复杂天然产物的生物合成提供新思路，其分步工程化方法更可推广至其他依赖氧化还原反应的代谢途径。周景文团队通过将合成生物学推向“电子水平”的精