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在生物医学研究中，胶原蛋白（Collagen）相关机制尚不明晰。为探究活细胞胶原蛋白沉积和原纤维组织动态，研究人员构建 mNGCol1α2 融合蛋白并运用多种显微技术。结果揭示了相关动态过程及分子事件，该研究为评估胶原蛋白在多种情况下的组装提供新途径。
在生命的微观世界里，细胞如同一个个精密的工厂，不断生产和组装着各种物质，其中胶原蛋白（Collagen）便是细胞分泌的一种至关重要的蛋白质。它是细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）的主要成分，约占哺乳动物总蛋白质量的 30%，广泛分布于皮肤、骨骼、软骨等结缔组织中，如同建筑物的钢筋框架，为组织提供机械强度和结构支撑。
然而，目前人们对胶原蛋白的了解还存在诸多空白。虽然光学显微镜曾用于观察细胞内胶原蛋白的早期运输，但对于细胞沉积胶原蛋白的详细组织情况，大多是通过静态的电子显微镜研究获得的。对于活细胞中胶原蛋白的沉积过程、原纤维的动态变化以及它们如何构建复杂的网络结构，我们知之甚少。此外，胶原蛋白的稳态极易受到氧化和还原应激的影响，其结构或表达的破坏不仅是皮肤衰老的自然结果，更是纤维化、骨质疏松等多种疾病的重要诱因。例如，随着年龄增长，COL1A1 型 I 胶原蛋白在皮肤中的表达会显著下调。在这样的背景下，深入研究胶原蛋白在活细胞中的动态过程，对于理解健康、衰老和疾病状态下的组织功能至关重要。
为了揭开这些谜团，英国杜兰大学（Durham University）等机构的研究人员开展了一项富有创新性的研究。他们通过构建一种明亮且光稳定的 mNGCol1α2 融合蛋白，并运用一系列先进的显微镜技术，对胶原蛋白的细胞内运输、细胞外原纤维形成过程进行了深入追踪和解析。
这项研究意义重大。它不仅为我们揭示了胶原蛋白在活细胞中的动态变化过程，让我们首次直观地观察到胶原蛋白原纤维的生长、相互作用以及网络构建的分子事件，还为评估胶原蛋白在皮肤模型和其他组织中的动态组装提供了新的方法和视角，有助于我们深入理解细胞外基质在健康、衰老和疾病过程中的作用机制，为相关疾病的治疗和干预提供潜在的靶点和理论依据 。该研究成果发表在《Scientific Reports》上。
研究人员在开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。首先是细胞培养技术，使用了人类纤维肉瘤细胞系 HT1080、原发性人骨肉瘤细胞系 Saos-2 和真皮 BJ 成纤维细胞等多种细胞系进行实验。其次，通过转染技术将 mNG-Col1α2 融合蛋白导入细胞。最重要的是，利用了多种显微镜技术，如共聚焦显微镜（Confocal Microscopy）、全内反射荧光显微镜（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRF）、超分辨率显微镜（Super-resolution Microscopy，包括 Airyscan 和 3D-SIM）等，实现对胶原蛋白在细胞内运输、分泌及细胞外原纤维形成等过程的实时、高分辨率成像观察。
下面来详细看看研究结果：
- mNG - Col1α2 融合蛋白标记的构建：为实现对 I 型胶原蛋白的高时空分辨率追踪，研究人员将明亮稳定的荧光蛋白 mNeonGreen（mNG）与 Col1α2 链融合，构建了 mNG - Col1α2 融合蛋白。该融合蛋白保留了 N 端信号肽，去除 N 端 ADAM 蛋白酶位点，防止融合蛋白分泌到细胞外基质后 mNG 标签被蛋白酶水解，从而便于观察原纤维形成过程12。
- mNG - Col1α2 的加工、修饰及运输：通过免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）和数据依赖采集质谱（Data - Dependent Acquisition Mass Spectrometry，DDA MS）分析，证实 mNGCol1α2 在转染的 HT1080 细胞中能正确加工和进行翻译后修饰，与关键加工蛋白如 P4HA 和 P4HB（PDI）相互作用，且在多个位点发生羟基化。利用布雷菲德菌素 A（Brefeldin A，BFA）处理细胞，发现 mNG - Col1α2 从内质网（Endoplasmic Reticulum，ER）向高尔基体的运输受阻，表明其运输途径符合预期34。
- mNG - Col1α2 的包装与运输载体：在转染的 HT1080 细胞中，mNG - Col1α2 融合蛋白定位于细胞质内的众多囊泡结构中，这些囊泡平均直径为 0.47μm，被认为是高尔基体到质膜的载体（Golgi to PM carriers，GPCs）。它们高度动态，主要向质膜方向移动，平均速度为 0.83μm s-1。通过共标记微管和 mNG - Col1α2，发现大多数胶原蛋白载体与微管相关，使用微管聚合抑制剂秋水仙碱处理后，囊泡沿微管的定向运动消失，表明 mNG - Col1α2 胶原载体向质膜的运输依赖于微管56。
- 胶原蛋白囊泡的命运：运用 TIRF 显微镜对 mNGCol1α2 进行研究，发现多个囊泡在质膜处发生 “爆发” 事件，代表胶原蛋白的胞吐过程。囊泡在接近质膜时会短暂静止，平均持续时间为 33.4s，可能是被肌动蛋白 / 肌球蛋白细胞骨架捕获并停靠在质膜上，随后释放 mNG - Col1α2 cargo7。
- 细胞外沉积的 mNG - 胶原蛋白原纤维的超分辨率成像：在表达 mNG - Col1α2 的 Saos-2 细胞中，研究人员利用超分辨率显微镜观察到细胞外沉积的胶原蛋白原纤维。这些原纤维直径与电子显微镜研究结果相符，且 mNG - Col1α2 能整合到未标记的天然胶原蛋白晶格中，形成单一原纤维或束。3D-SIM 超分辨率显微镜还观察到单个原纤维中的小环结构89。
- 细胞外胶原蛋白原纤维的动态变化：研究发现，沉积的胶原蛋白网络即使在几分钟的短时间尺度内也具有动态性，会发生弯曲。通过长时间活细胞成像，观察到细胞外胶原蛋白原纤维的生长和多种动态现象，包括原纤维沿已有原纤维生长并束状化、分叉，原纤维交叉，相遇并连接，弯曲原纤维伸直，原纤维成环，原纤维相互缠绕等1011。
在研究结论和讨论部分，研究人员成功捕获了胶原蛋白分子分泌的瞬间，并建立了成像活细胞原纤维形成和组织的系统。他们发现胶原蛋白通过微管运输到细胞周边，在细胞膜处停留一段时间后释放。mNG - Col1α2 融合蛋白可参与细胞外原纤维形成，并成功整合天然 I 型胶原蛋白。同时，观察到的胶原蛋白原纤维动态行为在之前的电子显微镜研究中已有预测，但此次是首次在活细胞亚细胞水平记录到这些高阶网络的发生和发展。不过，该研究是在二维细胞培养环境中进行的，部分现象在体内可能有所不同。未来可将该研究方法拓展到三维环境，进一步探究不同组织类型和胶原蛋白类型在衰老和疾病中的作用机制。总体而言，这项研究为深入理解细胞外基质的组装和组织提供了新的视角，为相关领域的研究开辟了新的方向。
