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在生物材料研究中，设计能模拟细胞与细胞外基质（ECM）相互作用的水凝胶是一大挑战。研究人员开展了水凝胶平台设计的研究，发现含动态和共价网络 RGD 配体的软凝胶可促进内皮细胞黏附和铺展，为组织工程等提供了新方向。
在生物材料的奇妙世界里，水凝胶一直扮演着至关重要的角色。它就像一个微观的 “魔法花园”，为细胞提供生长和发育的 “土壤”，在组织建模和再生领域有着巨大的潜力。然而，目前这个 “魔法花园” 并不完美，存在着诸多问题。细胞在自然组织中与周围的细胞外基质（ECM）有着复杂而精妙的相互作用，可现有的水凝胶却难以精准模拟这种互动。比如，要确定哪些基质特征对促进生理过程最为关键是个大难题，而且在研究中很难单独调整像基质刚度、应力松弛、黏附配体的流动性等变量。为了攻克这些难题，推动生物材料领域的发展，来自未知研究机构的研究人员踏上了探索之旅，开展了一项关于水凝胶设计的研究。他们的研究成果发表在《Acta Biomaterialia》上，为生物材料的发展带来了新的曙光。
研究人员用到的主要关键技术方法包括：首先，通过合成不同的聚合物网络，制备具有特定组成的水凝胶。然后，利用荧光去极化、圆二色谱（CD）、透射电子显微镜（TEM）、F?rster 共振能量转移（FRET）、横向弛豫核磁共振光谱（T2-NMR）和流变学等技术对水凝胶进行表征。在细胞实验方面，采用免疫细胞化学染色，结合共聚焦显微镜观察细胞在水凝胶中的黏附、铺展和相关蛋白表达情况，并通过软件对细胞面积、黏着斑数量和大小等进行量化分析 。
水凝胶设计和具有多重纳米纤维的混合水凝胶的表征
研究人员设计了一种混合水凝胶，它由共价交联的聚乙二醇（PEG）网络和自组装肽两亲分子（PA）网络相互穿透构成。PEG 是水凝胶中常用的合成聚合物，而 PA 可以自组装形成纳米纤维结构。通过调整两个网络的比例和成分，能独立调节水凝胶的粘弹性和 RGD 配体的流动性。研究人员还通过改变 PA 中 β- 片层区域的肽序列，制备了具有不同 RGD 配体流动性的 PA，即 “Fast-RGD” 和 “Slow-RGD”。利用荧光去极化和 T2-NMR 技术证实了 Fast-RGD 的 PA 中 RGD 配体具有更高的流动性。同时，通过合成不同立体化学构型的 PA，利用 FRET 和 CD 技术验证了可形成离散的纳米纤维网络，减少分子水平的混合。
调整混合水凝胶的刚度和应力松弛
PEG-PA 系统具有多个可调节变量。水凝胶的刚度主要受 PEG 臂交联比例和 PEG 重量分数的影响，增加这两个因素会使水凝胶变硬。研究发现，只有 40% PEG 臂被 MMP 可降解交联肽交联的水凝胶能够快速松弛应力。在该研究中，Fast-RGD 和 Slow-RGD 系统应力松弛半衰期分别为 76 秒和 208 秒，而长松弛凝胶和硬凝胶在应力松弛方面表现较差。此外，PA 的加入显著影响水凝胶的粘弹性，不含 PA 的 PEG 水凝胶模量较低且应力松弛行为不明显。
混合水凝胶中黏着斑形成和内皮细胞铺展
内皮细胞在非常柔软且能松弛应力的水凝胶上形成网络的能力最强。研究人员将人脐静脉内皮细胞（hUVECs）在 2D 和 3D 的 PEG-PA 水凝胶上培养，发现含有 RGD 配体同时存在于动态 PA 网络和共价 PEG 网络的水凝胶（如 Fast-RGD+PEG-RGD 和 Slow-RGD+PEG-RGD），能显著促进细胞黏附和铺展。通过免疫细胞化学染色和共聚焦显微镜观察，发现这些条件下的细胞形成了更多、更大且更成熟的黏着斑，肌动蛋白应力纤维也更明显。相比之下，只在 PEG 网络上有 RGD（PEG-RGD）的水凝胶，细胞黏着斑较小且数量较少；而只在 PA 网络上有 RGD（Fast-RGD 或 Slow-RGD）的水凝胶，细胞黏附和铺展效果也不如双网络都有 RGD 的水凝胶。同时，水凝胶的粘弹性对细胞黏附形成也很重要，软凝胶但不能快速松弛应力（长松弛凝胶）和硬凝胶，即使含有 RGD，也无法形成良好的黏着斑。对细胞中肌动蛋白和黏着斑相关蛋白（如 vinculin）染色强度的量化分析，进一步证实了上述结论。而且，研究还发现 RGD 配体的呈现方式和水凝胶粘弹性会改变黏着斑的数量、大小和形状，Fast-RGD+PEG-RGD 条件下细胞在 3D 水凝胶中的铺展面积最大。
在结论与讨论部分，研究人员成功开发了一种高度模块化的水凝胶平台。通过该平台，他们发现可以通过调整 PEG 网络的浓度和共价交联程度来调节水凝胶的粘弹性，包括刚度和应力松弛。并且，具有不同立体化学构型的 PA 纳米纤维可形成离散的纳米纤维网络，减少分子混合。在功能化 RGD 配体后，发现内皮细胞在柔软且能快速松弛应力的水凝胶中铺展效果最佳，且当 RGD 配体同时存在于共价 PEG 网络和动态 PA 网络时，细胞的铺展和黏附形成得到显著优化，高流动性的 PA 分子比低流动性的更有利。这一研究结果意义重大，为理解特定基质特征如何影响细胞 - 材料相互作用提供了新的视角，表明仅提供单一 RGD 配体呈现模式的系统可能无法充分模拟黏附成熟的不同方面。由于自组装肽网络可轻松整合到任何共价水凝胶基质中，这项研究有望显著提高许多体外细胞培养平台的生理相关性，为组织工程和疾病建模等领域的发展奠定了坚实基础，推动生物材料科学朝着更精准模拟生理环境的方向大步迈进。
