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本文聚焦微生物机器人与合成生物学交叉领域，阐述其在细菌药物递送系统中的进展。探讨了生物杂交细菌微型机器人（biohybrid bacterial microrobots）的研发，包括其在推进、 cargo delivery、检测和生物相容性方面的成果，分析面临的挑战并展望未来，为相关研究提供全面参考。
1. 引言
有效的药物递送一直是医学领域的难题。微生物机器人学和合成生物学的融合催生了生物杂交微型机器人用于药物递送这一新兴研究领域。这一融合的历史可追溯到 400 年前显微镜的发明，它为生物学和工程学的发展奠定了基础。20 年前，生物医学微型机器人领域兴起，受微生物能力启发，致力于生产微型机器；同时，合成生物学使人们能够研究和操纵微生物。本文旨在综述这两个领域的发展，以及它们如何融合为药物递送带来新的可能。
1.1. 微生物机器人在医学中的兴起
微生物机器人的概念源于机器人学、材料科学和生物医学工程的交叉，旨在开发能在人体内执行任务的微型设备，如靶向药物递送、微创手术和诊断程序。1867 年，詹姆斯?克拉克?麦克斯韦提出的控制理论影响了机器人系统；1940 年代，约翰?冯?诺伊曼等人奠定了微型机器的理论基础；1950 年代，集成电路的发明是机器人发展的重要里程碑。1959 年，理查德?费曼提出在原子尺度上进行操纵和构建的想法，点燃了生物医学微型机器人的概念。1980 年代，微机电系统（MEMS）的发展促进了微型执行器、传感器和机器人组件的创造；1990 年代，微制造技术使亚毫米级机器人的制造成为可能。然而，微型机器人在人体内面临诸多挑战，如低雷诺数环境下的流动条件、阻力和能源限制等，促使人们从自然界获取灵感，开发新的运动方法。
1.2. 生物工程和合成生物学的兴起
生物工程和合成生物学从单纯观察发展到生产高度复杂的、经过基因和化学修饰的活系统。细菌因其自主运动和与其他生物及非生物相互作用的能力，在诊断和治疗应用中具有潜力。1868 年和 1882 年，威廉?布施和弗里德里希?费莱森分别尝试用化脓性链球菌治疗癌症患者；威廉?科利使用活的链球菌菌株、热灭活细菌及其毒素（科利毒素）治疗无法手术的骨和软组织癌症，这可视为免疫疗法的起源。1970 年代，重组 DNA 技术的发现使细菌的基因工程成为可能，生产出第一种商业化的重组表达蛋白 —— 人胰岛素；同时，卡介苗（BCG）获得监管批准用于治疗浸润性膀胱癌。近年来，合成生物学借助 DNA 合成和测序成本的降低以及 CRISPR 基因编辑工具的出现，取得了新的进展，开发出多种具有改进靶向和药物递送特性的细菌菌株，但细菌疗法在临床应用中仍面临挑战，如在动物模型中的有前景的抗肿瘤疗效尚未完全转化到人体试验中。
2. 微生物机器人
微生物机器人是一种能在外部能量源刺激下进行时空控制运动，并基于其传感器、执行器和控制系统执行任务的小型可编程设备。细菌虽具有类似微生物机器人的特性，但浓度梯度趋化在大规模 “导航” 中效率较低，微生物机器人领域为此提供了多种非 tethered 控制方法。
2.1. 能源
为体内微生物机器人供电的方式受其小尺寸和生物体复杂性的限制。车载电源（如电池）能量密度低，MEMS 基发电机虽能达到足够能量密度，但制造复杂且成本高。无线传输的外部电源（如电、光、声和磁）更具优势，但各有优缺点。电驱动能提供高效驱动，但可能干扰体内电刺激；光驱动适用于精确控制，但组织穿透深度有限；声驱动能实现非侵入性深层组织穿透，但效率和加热方面存在挑战；磁驱动能提供非侵入性控制，组织穿透深度大，但材料和形状设计可能更复杂。选择最佳能源高度依赖于具体应用。
2.2. 推进与导航
推进和导航对靶向治疗至关重要，可提高微型机器人在靶位点的积累，改善治疗效果。微尺度推进与宏观尺度在物理和机械原理上有很大不同，低雷诺数环境下粘性力主导，需要非互惠运动来实现净平移。受自然界启发，人们开发了多种仿生设计，如基于细菌鞭毛旋转的螺旋推进和基于真核生物鞭毛和纤毛的行波推进。不同能源驱动的微型机器人各有特点，如庄等人提出的电驱动金微 / 纳米电机，在交流电场下可实现可控运动，但尚未在医学相关的体外或体内环境中成功应用；冯等人开发的光驱动纳米火箭，通过光 - 热 - 化学能转换实现治疗剂的递送；阿加哈尼等人提出的声学驱动空心微壳，可在不同流体中实现推进；王等人设计的磁性和 pH 响应性螺旋微游泳器，可在酸性 pH 下实现药物释放，但在体内酸性肿瘤微环境中的药物释放尚未得到进一步验证。
2.3. 检测与定位
安全可靠地应用微型机器人作为药物递送系统需要实时定位、成像和反馈控制策略。体内成像需考虑组织复杂性和穿透深度，不同成像方式各有优劣。
2.3.1. 基于光和辐射的检测
体内共聚焦显微镜是一种基于光的成像方法，分辨率高，但仅限于浅表面或半透明眼睛的检测；红外辐射检测依赖于物体的热辐射，但维持微型机器人高于周围环境的温度具有挑战性；血管内光学相干断层扫描（IVOCT）可生成高分辨率的血管图像，但受限于导管可到达的血管区域；荧光透视是一种基于 X 射线的成像方法，帧率高但分辨率相对较低，且存在辐射剂量问题；计算机断层扫描（CT）是一种 3D 成像方法，分辨率较高，但辐射暴露较高；正电子发射断层扫描（PET）灵敏度高，穿透深度不受限，但分辨率较低，成本高且采集时间长。
2.3.2. 基于声学的检测
超声成像分辨率较高，组织穿透性好，帧率足够用于实时成像，成本低且生物相容性好，但存在信噪比低和受强反射组织结构影响的问题。卡斯特利亚诺斯 - 罗夫莱斯等人将基于全氟戊烷的液体微滴掺入藻酸盐水凝胶中作为超声造影剂，用于检测微型机器人；韩等人在原位膀胱癌小鼠模型中，利用水凝胶基微型机器人的双开口气泡捕获腔设计和磁性纳米颗粒，实现了对微型机器人的体内检测和导航。
2.3.3. 基于电和磁的检测
电感检测（电磁跟踪）依赖于磁场与导电材料的相互作用，可用于微型机器人的定位；磁共振成像（MRI）基于电感检测原理，具有较好的空间分辨率和软组织对比度，但成本高，灵敏度低，采集时间长；磁性粒子成像（MPI）是一种新型成像方法，具有高时间和空间分辨率，但尚未在临床应用中广泛使用，其临床转化面临成本和制造维护等挑战。
2.4. 微型机器人用于靶向治疗的当前局限性
微型机器人在过去十年取得了显著进展，但仍面临诸多挑战。实现精确运动和导航需要高效的能量传输，同时避免对组织造成不良影响，不同能源的穿透深度和组织阻挡情况不同，且可能限制微型机器人的材料和形状选择。微尺度运动受低雷诺数环境、复杂流体结构和组织的影响，促使人们将微型机器人与生物材料融合，利用生物的运动和传感能力。
3. 生物工程和合成生物学
合成生物学为改造细菌提供了手段，使其能对特定刺激做出响应，成为强大的治疗工具。细菌的遗传和化学修饰各有优缺点，遗传修饰在细菌二元分裂时保持，而化学修饰会随分裂稀释。在治疗电路设计中，刺激作为输入线索，产生推进与导航、货物递送、检测和生物相容性等输出。
3.1. 推进与导航
细菌可通过旋转鞭毛和固有趋化机制自我推进并在远离给药部位积累。细菌趋化可分为多种类型，如趋化性（对化学物质或氧气水平的感知）。细菌肿瘤趋化现象已被广泛研究，其在肿瘤微环境中的积累机制包括对缺氧区域的偏好、肿瘤相关血管通透性的变化、免疫细胞清除减少以及化学吸引剂的影响等。此外，基因工程传感电路可增强和控制细菌向肿瘤微环境和其他疾病特异性环境的推进，如对天冬氨酸、四硫代硫酸盐、过氧化氢和群体感应分子的感知。通过基因编码的生物传感器可引导工程细菌的生长和增殖，如对 pH、氧气、乳酸等环境线索以及外部提供的 L - 阿拉伯糖或水杨酸的响应。多个遗传电路的复用可提高靶组织的特异性，如钱等人设计的工程减毒鼠伤寒沙门氏菌 ELH1301 菌株，能感知缺氧和高乳酸浓度，在体内外均表现出较高的特异性生长。此外，在细菌表面展示靶向生物大分子可控制其定植位点，如表达肽、抗体、抗体片段和纳米抗体等，化学修饰也可增强细菌的靶向和定植特性。
3.2. 货物递送
工程细菌可在疾病部位自我推进并产生和释放药物，增加药物在所需部位的浓度，减少对健康组织的暴露。多种研究报道了基因工程细菌能够在体内产生和分泌药物活性货物，包括毒素、免疫调节因子、血管生成抑制剂、肿瘤（新）抗原、前药转化酶、代谢调节剂和基因疗法等。不同的分泌策略，从简单的分泌标签到复杂的 3 型分泌系统，都被用于将货物递送到细胞外和细胞内目的地。此外，化学策略如将负载的脂质体、胶束和其他纳米材料与细菌载体结合，也被用于增强货物递送。特别是与细菌固有免疫刺激特性协同的货物递送，在癌症治疗中具有很大潜力，如通过分泌细胞因子和（新）抗原来调节免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用。细菌的群体感应机制可用于时空微调货物释放，但受细菌定植和噬菌体裂解基因相关突变压力的限制。
3.3. 检测与定位
非侵入性、强大且实时的检测技术对细菌疗法的临床转化和微生物学研究至关重要。在小动物研究中，主要使用生物发光和荧光报告基因来研究细菌的积累和行为，但这些基于光的策略受组织穿透深度和空间分辨率的限制，无法转化到人体应用。其他检测方法如检测粪便和尿液样本中的治疗细菌或其代谢物，虽具有非侵入性和定量性，但无法提供细菌定植位点的信息。目前需要具有深层组织穿透、高分辨率、高灵敏度和实时反馈能力的检测系统，以提高细菌疗法的安全性和有效性。
3.4. 生物相容性与毒性
细菌作为活的治疗剂在生物相容性和安全性方面存在独特挑战。通过删除或修饰毒力基因（如毒素或病原体相关分子模式）可减弱细菌的毒力，如鼠伤寒沙门氏菌 VNP20009 菌株通过删除 msbB 和 purI 基因，降低了毒力并实现了生长控制。然而，过度减弱毒力会影响细菌的定植和免疫调节能力，因此需要平衡安全性和有效性。近年来，响应性和可调节的遗传电路被提出，如基因工程的自杀开关、群体感应系统和营养缺陷型菌株等，可作为生物遏制系统，防止环境污染。此外，合成策略可用于隐藏细菌的 PAMPs，减少免疫细胞的识别和清除，如用哺乳动物细胞膜或可调节的聚合物涂层伪装细菌表面。同时，还需考虑细菌疗法的长期影响和遗传元件的稳定性，如监测水平基因转移和优化质粒表达系统。
3.5. 合成生物学方法用于细菌疗法的局限性
尽管合成生物学使细菌具有多种功能，但工程细菌在癌症治疗的首次临床试验中未能复制临床前研究的有前景的治疗效果，可能是由于治疗窗口狭窄，无法引发有效的抗肿瘤反应。扩大治疗窗口需要进一步研究减轻全身影响，开发远程控制细菌推进和货物释放的方法，以及强大的实时检测技术来评估细菌的生物分布和选择高效定植的菌株。生物杂交策略结合了合成微生物学和微生物机器人学的优势，为克服这些局限性提供了新的途径。
4. 生物杂交细菌基药物递送载体的治疗效果
自 1989 年卡介苗获批以来，除细菌疫苗外，其他细菌疗法尚未获批，这凸显了细菌作为活的治疗剂面临的挑战，如选择性定植、精确控制货物释放、实时检测和生物相容性等问题。合成生物学和微生物机器人学的发展为解决这些问题提供了新的思路，生物杂交系统结合了两者的优势，有望克服细菌疗法的临床转化障碍。
4.1. 生物杂交对推进和货物递送的控制
将细菌的固有运动机制与远程外部策略相结合，可有效控制细菌微型机器人在靶位点的定植和货物释放，降低所需剂量并改善治疗窗口。生物杂交微型机器人可通过光、超声和磁场等不同模式进行控制。
4.1.1. 基于光的控制
基于光的导航策略具有高精度和动态控制能力，可通过调节光的强度和持续时间来增强细菌微型机器人的货物递送。受光遗传学机制调节的对蓝光敏感的微生物在工业生产中得到广泛应用，为基于光的控制提供了基础。为了增加可见光在体内应用的穿透深度，开发了上转换材料，可将近红外光转换为局部蓝光。潘等人将修饰有肿瘤靶向叶酸分子的上转换纳米颗粒与基因工程大肠杆菌 Nissle 1917（EcN）共同给药，经近红外照射后，纳米颗粒将光刺激转换为蓝光，激活启动子并促使 EcN 产生免疫细胞因子 TNF - α，在 4T1 肿瘤小鼠模型中观察到肿瘤生长抑制和肿瘤内促炎细胞因子的上调。此外，功能化有催化光热转换纳米材料的生物杂交微型机器人可用于疾病环境的局部光热治疗，如邢等人将吲哚菁绿纳米颗粒与磁螺菌 AMB - 1 细菌结合，经近红外光照射后实现了肿瘤的完全缓解；李等人开发的 EcN 与聚多巴胺纳米颗粒结合的微型机器人，在两种结肠癌小鼠模型中实现了肿瘤生长的抑制和免疫抑制环境的调节。光热产生的热量还可用于激活热敏感启动子，控制治疗活性货物的表达。此外，还可通过使用光敏细菌或基因工程使细菌成为光驱动的方式实现基于光的控制。
4.1.2. 基于声学的控制
超声在生物杂交微型机器人的研究中得到广泛应用，可实现空间引导、原位产生和释放治疗活性分子以及传递机械力。通过基因编码的气泡囊可实现超声引导，杨等人在大肠杆菌 BL21 和鼠伤寒沙门氏菌 YB1 中异源表达气泡囊基因簇，使其对声辐射力产生响应，在体外和体内模型中实现了细菌的聚类、定位控制和引导，促进了细菌在肿瘤中的迁移和定植，降低了肿瘤生长速率。通过超声刺激激活热响应启动子，可实现细菌微型机器人原位产生治疗剂，如阿贝迪等人利用聚焦超声刺激基因工程 EcN，激活热敏感启动子，持续表达和分泌免疫检查点抑制剂，在皮下 A20 肿瘤小鼠模型中减缓了肿瘤生长；陈等人在大肠杆菌 MG1655 中表达 IFN - γ，经聚焦超声刺激后，在 4T1 肿瘤小鼠模型中观察到直接和远隔抗肿瘤效应以及肺转移的减少。细菌生物杂交疗法还可用于靶向声动力治疗，通过超声激活附着在细菌表面的声敏剂产生活性氧（ROS），如王等人开发的基于基因工程大肠杆菌 BL21 与具有声动力效应的锆纳米颗粒结合的生物杂交微型机器人，在体内实现了肿瘤生长的抑制和全身抗肿瘤免疫的激活；范等人开发的由非典型韦荣氏菌与金黄色葡萄球菌细胞膜包被的钛酸钡纳米立方体结合的口服微型机器人，在小鼠模型中实现了对原位 CT26 肿瘤的靶向和声动力治疗，同时改变了小鼠的微生物群组成。此外，基因编码的气泡囊在聚焦超声刺激下可产生机械力，导致细菌裂解并释放货物，但该策略的免疫原性和清除率仍需进一步研究。
4.1.3. 基于磁性的控制
磁性响应细菌可通过不同类型的磁场（如定向、梯度和时变磁场）来引导其运动和行为。最初，天然磁性细菌（趋磁细菌，MTB）被研究并用于生物杂交微型机器人的开发，如费尔福尔等人将羧化的 SN - 38 负载纳米脂质体与海洋磁球菌 MC - 1 细菌结合，在定向磁场作用下，部分细菌可靶向皮下 HCT116 肿瘤，但未观察到治疗反应；邢等人利用旋转磁场增加了磁螺菌 AMB - 1 在肿瘤小鼠中的定植，但由于对照组肿瘤也出现生长抑制，无法确定该生物杂交微型机器人的抗肿瘤效果。由于 MTB 的水生、非益生菌起源和复杂基因组，人们开始研究对益生菌或非致病菌株进行磁性功能化，如通过共价结合、非共价共轭和静电吸附等方法将磁性微 / 纳米颗粒与细菌结合。均匀定向时不变磁场可约束细菌微型机器人的自我推进方向，如阿科尔波格鲁等人开发的基于大肠杆菌 MG1655 的生物杂交微型机器人，在定向磁场作用下可被 “引导” 向肿瘤球状体；空间变化的梯度磁场可对磁性响应细菌微型机器人施加拉力，促进其在肿瘤部位的积累，如阿科尔波格鲁等人和奥布里等人分别通过实验证明了这一点。此外，交变磁场（AMFs）可通过热诱导效应影响微型机器人的行为，如陈等人利用 AMFs 激活基因工程 EcN 中热敏感启动子控制的基因表达
