基于高通量微滴微流控技术的丝状真菌基因敲除快速鉴定系统开发与应用

本研究针对传统丝状真菌基因敲除突变体筛选方法通量低、耗时长的问题，开发了基于微滴微流控的高通量筛选平台。研究人员通过将Fusarium graminearum转化子封装在皮升级水包油乳滴中，结合抗生素抗性生长表型筛选，实现了28,800个转化子/小时的高通量筛选，从24,000个转化子中成功鉴定出2个真实敲除突变体。该技术将筛选时间缩短3倍，为真菌功能基因组学研究提供了新工具。

　　

在真菌王国中，丝状真菌就像自然界的神秘工程师，既能分解有机物质维持生态平衡，又能引发农作物毁灭性病害。科学家们通过基因敲除技术来破解这些微生物的生命密码，但传统筛选方法就像用放大镜找蚂蚁——需要将转化子铺在琼脂平板上等待5-10天形成菌落，不仅效率低下（仅10⁴个细胞/小时），还容易因菌落重叠导致假阳性。更棘手的是，丝状真菌的菌丝体结构让流式细胞分选技术(FACS)也束手无策，这些瓶颈严重阻碍了真菌功能基因组学研究。

针对这些挑战，美国陆军研究实验室等机构的研究团队在《Analytica Chimica Acta》发表了一项突破性研究。他们巧妙地将微滴微流控技术应用于丝状真菌筛选，就像为每个真菌细胞打造了独立的"培养舱"——将Fusarium graminearum转化子封装在皮升级水包油乳滴中，通过潮霉素B抗性筛选和钙荧光白染色监测菌丝生长，建立了一套自动化、高通量的筛选体系。

关键技术包括：1）微流控芯片设计实现单细胞封装；2）基于生长表型的乳滴分选系统；3）使用Fusarium graminearum PH-1野生型菌株构建转化文库；4）荧光标记的菌丝生长动态监测。研究人员首先优化了乳滴内真菌培养条件，随后用已知比例的突变体/野生型混合样本验证系统可靠性，最终应用于实际转化文库筛选。

【Workflow and design of the droplet microfluidic system】
研究团队设计的微流控芯片系统包含三个关键模块：细胞封装单元将转化子与培养基、抗生素共同包裹在直径约50μm的乳滴中；培养单元维持乳滴稳定培养48小时；检测分选单元通过钙荧光白染色信号识别菌丝生长阳性乳滴。该系统实现了单转化子分辨率下的表型筛选，避免了传统方法中菌落交叉污染的问题。

【Fungal strains and culture conditions】
选用Fusarium graminearum野生型PH-1菌株，通过原生质体转化法构建敲除文库。在含1M蔗糖的Fusarium再生培养基中制备原生质体，转化后乳滴内使用含潮霉素B的TSB培养基进行培养。添加10μg/mL钙荧光白(CFW)实现菌丝生长荧光标记，分选后的阳性乳滴直接点种于琼脂平板进行验证培养。

【Conclusions】
该研究成功建立了通量达28,800个转化子/小时的微滴筛选平台，从24,000个转化子中鉴定出5个候选突变体，经PCR验证其中2个为真实敲除株。与传统方法相比，该系统将Fusarium graminearum原生质体生长观察时间缩短3倍，且无需后续单孢子分离步骤。单细胞表型分析能力显著减少了后处理工作量，错误率低于0.02%。

这项技术的突破性在于：首次将微滴微流控应用于丝状真菌基因敲除筛选，解决了菌丝体结构导致的FACS技术适用性难题；通过生长表型直接筛选避免了标记基因引入带来的假阳性；皮升级反应体系极大降低了试剂消耗。研究为真菌致病机制研究、工业菌株改造等领域提供了强大工具，特别适用于需要大规模筛选的真菌-宿主互作研究和次级代谢产物开发。未来通过整合CRISPR等基因编辑技术，该平台有望成为真菌功能基因组学研究的标准流程。