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为解决蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPIs）研究方法的局限性问题，研究人员以超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）与抗 sfGFP 纳米抗体增强子的相互作用为模型，对比多种生物物理方法。结果表明多方法联用能更全面可靠地表征 PPIs，对深入理解生物过程意义重大。
在生命科学领域，蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPIs）如同细胞活动的 “密码”，掌控着细胞内众多关键进程，也是探究疾病分子机制的关键所在。然而，以往研究 PPIs 的方法存在诸多不足。例如，一些方法需要将结合伙伴固定在固体支持物上，这可能改变分子原本的相互作用特性；而且单一方法往往只能获取有限的信息，难以全面深入地了解 PPIs 的全貌。为了突破这些困境，来自加拿大莱斯布里奇大学、蒙大拿大学等机构的研究人员开展了一项极具价值的研究。他们以超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）与抗 sfGFP 纳米抗体增强子的相互作用为模型系统，对多种适用于溶液环境的生物物理方法进行比较和评估。最终研究发现，多种方法联用能够更完整、可靠地对 PPIs 进行表征，这一成果为生命科学研究打开了新的大门，对深入解析细胞内生物过程、揭示疾病机制以及开发新的治疗策略具有重要意义，该研究成果发表在《Analytical Biochemistry》上。
研究人员运用了多种关键技术方法。其中包括微尺度热泳（MST），它利用分子在温度梯度中的运动来监测扩散，从而测定结合亲和力；等温滴定量热法（ITC），可直接测量相互作用时吸收或释放的热量，获取热力学参数；多波长分析超速离心（MW - AUC）和荧光检测分析超速离心（F - AUC），通过光谱和流体动力学分析，确定复合物的组成和化学计量比等；荧光相关光谱（FCS），从单分子层面观察分子动态和相互作用；尺寸排阻色谱联用多角度静态光散射和动态光散射（SEC - MALS 和 SEC - DLS），用于测量分子重量和扩散系数。
在研究结果方面：
- UV - Vis：通过光谱分解，分析 1:1 和 2:1 混合物组成，发现纳米抗体与 sfGFP 结合会导致 sfGFP 的 UV - Vis 吸收光谱出现轻微的增色和减色效应，这表明在实验条件下，未结合纳米抗体时 sfGFP 发色团可能发生了去质子化。
- MST：测定出解离常数（KD）为 1.53 nM，标准误差为 3.98 nM，信号噪声比为 14.1，结果显示两者结合力强，但由于接近仪器灵敏度极限，测量误差较大。
- ITC：实验得到KD为 1.000 ± 0.633 nM，化学计量比（n）为 0.917，熵为 13.76 J/mol?K（95% 置信水平），信号噪声比为 117，其结果与 MST 相符，进一步证实了两者的强相互作用，但也受仪器检测限限制，难以准确测定更低亲和力的相互作用。
- MW - AUC：分析揭示出自由 sfGFP、自由纳米抗体和它们的 1:1 复合物三种不同的物种，其摩尔质量测量值与理论值相符，还能精确确定各物种的部分浓度，验证了复合物的 1:1 化学计量比，但因检测器动态范围限制，难以准确测量KD浓度。
- Fluorescence AUC：测量得到KD为 1.72 nM，与其他方法结果一致，在高荧光产量条件下可扩展 AUC 的动态浓度范围，但无法检测未标记纳米抗体的流体动力学参数。
- FCS：测量了 sfGFP 结合纳米抗体前后的扩散系数，发现结合后扩散系数降低，但测量值与 AUC 和 DLS 存在差异，可能存在系统误差。
- SEC - MALS 和 DLS：SEC - MALS 测量了分子重量和扩散系数，但分离相似大小分子的分辨率有限，可能受到杂质影响，导致复合物分子重量被低估，DLS 测量的扩散系数也与 AUC 存在差异。
研究结论和讨论部分指出，多种生物物理方法在研究 PPIs 时各有优劣。MST、荧光 AUC 和 ITC 在测定KD方面结果相近，但都接近其动态范围极限；ITC 和 MW - AUC 在确定化学计量比上达成一致；MW - AUC 在提供扩散系数和摩尔质量方面表现更稳定；UV - Vis 光谱分解能准确分析混合物组成。综合多种方法可以相互补充，克服单一方法的局限性，从而更全面、准确地研究 PPIs，为生命科学领域的研究提供了更可靠的依据，推动相关疾病机制研究和治疗策略的开发。
