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乙肝病毒（HBV）共价闭合环状 DNA（cccDNA）难以清除，阻碍乙肝治愈。研究人员构建 HBV cccDNA 自生成稳定细胞系并筛选药物。结果筛选出 4 种有抗 HBV 效果的化合物，为抗 HBV 药物高通量筛选提供平台。
乙肝，这个隐匿在全球健康角落的 “幽灵”，长久以来都在威胁着人类的肝脏健康。尽管乙肝疫苗的广泛接种和抗病毒治疗的不断发展，但乙肝病毒（HBV）感染依旧是全球性的重大健康难题。据统计，超过 2.5 亿人长期遭受慢性 HBV 感染，他们面临着肝纤维化、肝硬化乃至肝细胞癌（HCC）等严重肝脏疾病的风险，每年约有 100 万慢性乙肝（CHB）患者因相关并发症离世。
目前获批的治疗药物，如核苷（酸）类似物和聚乙二醇化干扰素 α，虽能抑制病毒 pgRNA 逆转录、调节宿主免疫反应，却难以实现对乙肝的实质性治愈。原因就在于 HBV 共价闭合环状 DNA（cccDNA），它作为子代病毒产生的模板，稳定性极高，即便血清中 HBV DNA 在核苷（酸）类似物作用下检测不到，它依然能在肝细胞内核中 “安然无恙”，使得现有治疗方案难以达成功能性治愈。
在过去十年，针对 HBV 不同复制阶段的药物研发层出不穷，从 entry inhibitors、抗 HBV siRNA 或反义 RNA，到 capsid formation inhibitors、HBsAg release inhibitors，还有间接抗病毒疗法如 toll - like receptor agonists、免疫检查点抑制剂等。然而，多数药物仍处于临床或临床前阶段，比如抗 HBV siRNA 策略，虽在临床试验中尝试通过降低 HBsAg 水平、重振免疫反应来减少 cccDNA 水平，但中断治疗后病毒极易反弹。由于对围绕 HBV cccDNA 的生物学过程了解有限，传统的以特定靶点为导向的药物研发策略也受到了限制。
为攻克这些难题，来自国内的研究人员开启了一场关键的探索之旅。他们致力于构建一种能够简便、高通量检测 HBV cccDNA 的细胞系，进而为抗 HBV 药物筛选提供有力平台。最终，研究取得了重要成果，成功构建出 HBV cccDNA 自生成稳定细胞系，并筛选出 4 种具有抗 HBV 效果的化合物。这一成果意义非凡，为抗 HBV 药物的高通量筛选搭建了可靠的平台，有望推动乙肝治疗药物的研发进程，为众多乙肝患者带来新的希望。该研究成果发表在《Antiviral Research》上。
研究人员开展研究时运用了多种关键技术方法。在检测方面，使用实时 PCR（Hepatitis B Viral DNA Quantitative Fluorescence Diagnostic Kit；Sansure Biotech）对 HBV DNA 水平进行定量，利用 Thunderbird SYBR qPCR 进行 HBV RNA 定量 PCR。在细胞系构建上，基于功能互补概念，将病毒蛋白生产和 pgRNA 生成拆分为两个互补部分构建细胞系。
下面来看具体的研究结果：
- 质粒构建：研究使用的质粒基于先前报道的病毒骨架，通过多次 PCR（包括重叠 PCR）、酶切和连接完成构建，最终质粒序列展示于补充图（文中省略图示）。
- HBV 生物标志物检测：运用实时 PCR 技术对 HBV DNA 水平进行定量分析，同时采用特定的 qPCR 方法对 HBV RNA 进行定量，以此监测病毒相关指标。
- 互补 HBV cccDNA 自生成细胞系的原理：研究人员创新性地将病毒蛋白生产和 pgRNA 生成功能拆分成两个互补部分。其中一部分为 HBV helper，包含 HBV 核心、聚合酶、HBx 基因以及筛选标记（Shble博来霉素抗性基因），利用 2A 序列隔开 Zeocin 抗性基因与核心基因，并对系统进行了两项优化，以提高 Gluc - cccDNA 的产量。
在研究结论和讨论部分，HBV cccDNA 是乙肝病毒在感染肝细胞内核中持续存在的关键因素，作为转录模板，它的存在给 HBV 清除带来巨大挑战。但目前其合成和稳定的详细机制尚不明确，这主要是因为每个细胞中的 cccDNA 拷贝数极低却仍能维持功能，导致检测困难。而此次研究构建的无病毒乙肝 cccDNA 细胞培养系统，为抗 HBV 药物的高通量筛选提供了便捷且有价值的平台，有助于发现更多潜在的抗 HBV 药物，推动乙肝治疗领域的发展，对未来实现乙肝的治愈具有重要的意义。
