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葡萄牙牡蛎（Crassostrea angulata）卵母细胞冷冻保存困难，研究人员评估抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）作为冷冻保护剂添加剂的效果。构建三种重组蛋白，实验发现 TAT-MnSOD 能显著提高卵母细胞冻后存活率和受精率，为贝类卵母细胞冷冻保存提供新策略。
在全球水产养殖业蓬勃发展的当下，贝类养殖占据着重要地位。其中，牡蛎作为世界第二大养殖贝类，产量可观。在我国台湾地区，葡萄牙牡蛎（
Crassostrea angulata）更是经济价值极高的养殖品种。然而，牡蛎卵母细胞的冷冻保存却困难重重。这是因为牡蛎卵母细胞具有独特的形态特征，如体积大、多膜结构、表面积与体积比低以及渗透惰性部分较低等 。在冷冻和解冻过程中，细胞内外的冰晶形成会造成机械损伤，低温导致的渗透压变化、冷冻保护剂的溶剂毒性，还有内外源因素引发的氧化应激等，都会严重损害卵母细胞的质量，致使其存活率低、受精率低，幼体死亡率升高。目前，成功实现牡蛎卵母细胞冷冻保存的研究寥寥无几，已有的研究也未解决冷冻过程中的氧化应激问题。为了突破这一困境，提升牡蛎养殖的效率和质量，来自国内的研究人员开展了一项关键研究。
研究人员将目光聚焦于抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD），尝试将其作为冷冻保护剂添加剂，来缓解葡萄牙牡蛎卵母细胞冷冻保存过程中的氧化应激。他们构建了三种不同的重组锰超氧化物歧化酶（MnSOD），分别是与细胞穿透肽 TAT 融合的 TAT-MnSOD、MnSOD 和 MnSOD-TAT 。研究结果令人振奋，添加了 TAT-MnSOD 的实验组，冻后卵母细胞的存活率高达（74.5 ± 2.0）%，受精率达到（76 ± 7.4）% ，分别是基础冷冻保护剂组的 2.6 倍和 3.8 倍。这一成果发表在《Aquaculture》上，意味着细胞穿透抗氧化酶添加到冷冻保护剂溶液中，能显著提高葡萄牙牡蛎卵母细胞的存活率和受精率，TAT-MnSOD 成为贝类卵母细胞冷冻保存的理想添加剂。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是重组蛋白的制备，通过基因工程技术构建并在大肠杆菌中表达 TAT-MnSOD、MnSOD 和 MnSOD-TAT 三种重组蛋白；其次，利用蛋白质免疫印迹（western blot）分析技术，对重组蛋白进行检测和鉴定；最后，开展卵母细胞冷冻保存实验，将不同处理的卵母细胞进行冷冻和解冻，评估其存活率和受精率。
下面来看具体的研究结果：
- 重组蛋白的克隆、纯化和表征：通过蛋白质免疫印迹分析证实，三种重组蛋白 TAT-MnSOD、MnSOD-TAT 和 MnSOD 在大肠杆菌 BL21 中均成功合成，其分子量与预期相符。这为后续研究提供了可靠的实验材料。
- 卵母细胞冷冻保存实验：以 10% DMSO 作为基础冷冻保护剂，添加 5 μM 浓度的纯化重组 MnSOD 蛋白对牡蛎卵母细胞进行冷冻保存。结果显示，TAT-MnSOD 处理组的卵母细胞在冻后获得了最高的存活率和受精率。这直接表明 TAT-MnSOD 能有效提升卵母细胞冷冻保存的效果。
- 细胞穿透和酶活性分析：TAT 融合会降低 25 - 39% 的 MnSOD 活性，且 TAT 肽在 N 端融合比在 C 端融合更有利于细胞内化。这揭示了 TAT 融合位置对蛋白功能的影响，为优化重组蛋白设计提供了依据。
研究结论表明，葡萄牙牡蛎是重要的养殖贝类，但卵母细胞冷冻保存技术尚未完善。本研究开发的重组抗氧化酶 TAT-MnSOD 作为冷冻保存添加剂，有效解决了冷冻过程中氧化应激这一关键问题。在讨论部分，研究人员进一步强调了牡蛎在商业和生态方面的重要性。这项研究成果不仅为葡萄牙牡蛎卵母细胞的冷冻保存提供了切实可行的新方案，还为贝类养殖产业的可持续发展奠定了坚实基础，有望推动整个水产养殖业在种质保存技术上取得新的突破。
