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为解决分子胶诱导的新蛋白 - 蛋白相互作用（neoPPIs）检测难题，研究人员开展基于细胞裂解物的时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测技术研究。结果显示该技术可有效监测 KRAS-CYPA neoPPIs，有助于发现新型抗癌分子胶，推动癌症治疗发展。
在生命的微观世界里，蛋白质之间的相互作用就像一场精密的 “舞蹈”，它们的一举一动都影响着细胞的命运。而在癌症的 “舞台” 上，有一个 “麻烦分子”——KRAS（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）。KRAS 是人类癌症中最常发生突变的致癌基因之一，在胰腺癌、非小细胞肺癌和结直肠癌等多种恶性肿瘤的发展和进展中起着关键作用。当 KRAS 基因发生突变，尤其是 12、13 和 61 号密码子的突变，会导致其编码的 GTPase 蛋白持续激活，让细胞像脱缰的野马般疯狂生长，引发肿瘤。
长期以来，直接靶向 KRAS 困难重重。它对 GTP/GDP 具有高亲和力，且缺乏合适的结合口袋，传统的药物研发手段在它面前屡屡碰壁。尽管针对 KRAS G12C 突变的小分子抑制剂取得了一定进展，如索托拉西布（sotorasib）和阿达格拉西布（adagrasib），但对于其他 KRAS 突变体，如 G12D 和 G12V，仍然缺乏有效的治疗策略。
在这样的困境下，一种名为分子胶的新型小分子药物崭露头角。分子胶能够通过结合靶蛋白，诱导新的蛋白 - 蛋白相互作用（neoPPIs），为攻克 “不可成药” 的蛋白带来了希望。比如，它可以诱导 KRAS 与亲环蛋白 A（CYPA）形成稳定的 neoPPIs 复合物，从而破坏 KRAS 与效应蛋白的相互作用，抑制致癌信号传导。然而，目前发现和优化分子胶的过程充满挑战，亟需先进的筛选技术。
在此背景下，研究人员开展了一项重要研究。他们致力于开发和优化一种基于细胞裂解物的时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测平台，用于评估分子胶诱导的 KRAS-CYPA neoPPIs。这项研究成果发表在《ASPET Discovery》上，为癌症治疗领域带来了新的曙光。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是分子克隆和诱变技术，构建了多种带有不同标签的 KRAS 和 CYPA 质粒；接着通过细胞培养和质粒转染技术，获得表达相应蛋白的细胞；然后制备细胞裂解物，利用 TR-FRET 技术，结合特定的抗体组合，检测分子胶诱导的蛋白相互作用。
下面来看看具体的研究结果：
- KRAS-CYPA neoPPI TR-FRET 检测方法的开发：研究人员克隆了 20 种构建体，检测了 24 种质粒组合，通过细胞裂解物滴定研究确定最佳裂解物浓度。实验发现，RMC-7977 诱导的 KRAS-CYPA neoPPI TR-FRET 信号呈 2 相变化，即随着裂解物浓度增加，信号先升后降，呈现典型的钩状效应。同时，标签方向也会影响信号强度，例如 GST-CYPA 和 VF-KRAS 组合比反向标签组合的 S/B 比更高。这些结果证实了 RMC-7977 的分子胶活性，也证明了基于裂解物的 TR-FRET 检测方法的可行性。
- KRAS-CYPA neoPPI TR-FRET 检测方法的优化：研究人员测试了更多的标签和 TR-FRET 供体 / 受体对，包括利用 VF 标签的内置 Flag 表位序列，使用抗 Flag-D2 作为替代受体；还采用了更小的 Flag 和 His 标签。结果发现，不同组合都存在裂解物浓度依赖的 neoPPI 信号钩状效应和标签方向效应。通过比较不同组合的检测窗口，确定了 Flag-CYPA 和 His-WT KRAS 组合与抗 Flag-Tb / 抗 His-D2 抗体的组合具有更高的检测窗口，被选用于进一步的检测小型化和验证。
- KRAS-CYPA neoPPI TR-FRET 检测方法的小型化和验证：使用优化后的组合进行 RMC-7977 剂量响应实验，结果显示在 384 孔板 HTS 格式下，RMC-7977 对不同 KRAS 突变体（WT、G12C、G12D、G12V）诱导的 neoPPI 信号呈浓度依赖性增加，且 EC50值与纯化蛋白实验报道相符。将检测方法小型化为 1536 孔板 uHTS 格式后，该方法在两种板型中都表现出强大的性能，S/B 比均大于 30 倍，Z' 因子均大于 0.6，且在连续 3 天内保持稳定。这表明优化后的检测条件具有强大的稳定性，小型化的 uHTS 检测方法能够有效检测分子胶诱导的 KRAS-CYPA neoPPI 复合物。
研究结论和讨论部分指出，基于细胞裂解物的 TR-FRET 检测方法具有显著优势。它使用细胞裂解物，提供了更接近生理状态的环境，保留了 KRAS 的天然翻译后修饰和与其他蛋白的相互作用。该方法检测 RMC-7977 诱导的 neoPPI 的性能与现有纯化蛋白方法相当，且通过优化有效减轻了钩状效应。检测方法成功小型化为 384 孔和 1536 孔板格式，适用于高通量筛选，为发现针对 KRAS 驱动癌症的新型分子胶提供了有力工具。未来，利用该检测方法进行大规模化学筛选，有望发现更多有潜力的分子胶候选物。进一步优化检测方法，探索更多 KRAS 突变体、RAS 异构体和 CYPA 变体，结合其他技术，将更全面地理解分子胶诱导的 neoPPI 及其治疗潜力。这项研究为癌症治疗领域开辟了新的道路，为攻克 KRAS 相关癌症带来了新的希望。
