基于骨骼肌 DNA 甲基化率鉴别野生与养殖环颈雉

为解决非法野生动物贸易及野生与养殖动物难区分问题，研究人员开展环颈雉野生与养殖个体骨骼肌 DNA 甲基化率研究。结果显示两者甲基化率有显著差异，建立的鉴别技术准确率高，为相关执法及其他物种鉴别提供参考。

　　在全球生物多样性保护的战场上，非法野生动物贸易就像一场可怕的 “瘟疫”，正疯狂地侵蚀着无数物种的生存空间。为满足食品、宠物、娱乐、奢侈品收藏和医药等领域对野生动物及其产品的需求，大量野生动物被非法捕猎和交易，许多物种数量急剧减少，甚至濒临灭绝。在这样的严峻形势下，野生动物养殖被视为缓解野生种群压力的 “救星”，《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）也允许对圈养野生动物的至少第二代后代（F2）进行商业利用。然而，新的问题接踵而至，市场上频繁出现将野生捕获的动物产品伪装成 “圈养繁殖” 的现象，严重破坏了野生动物保护的成果。因此，开发一种能够准确区分野生和圈养动物的技术迫在眉睫。

东北林业大学的研究人员勇敢地迎接这一挑战，针对环颈雉开展了深入研究。环颈雉是世界上备受欢迎的狩猎物种，其骨骼肌肉质鲜美、营养丰富，在全球广泛养殖，既用于西方国家的野外放归狩猎，也作为东方国家的新型家禽用于肉类生产。但野生环颈雉受到法律严格保护，非法捕猎现象屡禁不止，在缺乏有效溯源验证手段的情况下，市场上野生与养殖环颈雉肉产品极易混淆，所以环颈雉成为检验肌肉 DNA 甲基化率鉴别方法可行性的理想模型。

研究人员经过不懈努力，取得了一系列重要成果。该研究发表在《Avian Research》杂志上，为野生动物保护领域带来了新的曙光。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，采集了 60 只圈养环颈雉（雌雄各 30 只）和 30 只野生环颈雉（雌雄各 15 只）的骨骼肌样本，包括胸大肌、肱三头肌、腓肠肌、股二头肌和颈肌。其次，利用全基因组甲基化测序（WGBS）技术对部分样本进行分析，筛选出差异甲基化区域（DMRs）和差异甲基化基因（DMGs）。最后，基于筛选出的 5 个甲基化位点（LOC116231076、LOC116242223、ATAD2B、EGFL6和HS2ST），运用甲基化敏感高分辨率熔解曲线（MS-HRM）技术构建定量检测体系。

研究结果

1. 基因组 DNA 甲基化情况：对 10 个胸大肌样本成功进行 WGBS，平均每个样本产生 2.29×10⁸条 clean reads ，碱基识别准确率和有效读长比都较高。全基因组中，CG 位点的胞嘧啶甲基化占主导，CHG 和 CHH 位点甲基化较少。圈养和野生环颈雉的甲基化模式相似，但圈养环颈雉中 80% 甲基化的类别更多。
2. 差异甲基化分析：共鉴定出 13,507 个 DMRs，其长度和在染色体上的分布存在差异，约 41.5% 位于基因组调控元件，15.9% 在远端基因间区域，15.9% 在启动子区域。KEGG 富集分析表明，差异甲基化基因主要与 MAPK 信号通路和钙信号通路相关，这两条通路都与运动有关。主成分分析（PCA）和聚类分析（CA）根据全基因组甲基化率数据清晰区分了野生和圈养环颈雉。
3. 鉴别体系构建：对 73 个 CG 位点进行 MS-HRM 检测，筛选出 16 个扩增效果良好的位点并构建标准曲线。进一步分析发现，LOC116231076、LOC116242223、ATAD2B、EGFL6和HS2ST这 5 个位点判别能力较强，被选入鉴别体系。
4. 鉴别能力评估：该鉴别体系在不同肌肉中的判别能力存在差异，单个位点的判别准确率在 63.70% - 100.00% 之间，组合位点的整体判别准确率在颈肌中可达 91.63%，在腓肠肌中甚至达到 100.00%。大肌肉（如胸大肌、腓肠肌和股二头肌）的判别准确率普遍高于小肌肉（如颈肌和肱三头肌）。
5. 体系性能测试：MS-HRM 体系重复性良好，变异系数在 0 - 0.009 之间；在不同 qPCR 设备上的重现性可接受；灵敏度较高，模板浓度大于 0.2 ng/μL 时能正确读取熔解温度；对哺乳动物和鸟类具有通用性。此外，研究还发现不同试剂盒对 MS-HRM 精度影响较大，PowerUp? SYBR? Green Master Mix 无法产生合格信号，而 HRM analysis kit with EvaGreen 效果良好。

研究结论与讨论

这项研究以环颈雉为研究对象，成功建立了基于骨骼肌 DNA 甲基化率鉴别野生与养殖环颈雉的有效技术体系。虽然全基因组甲基化测序成本较高且对参考基因组质量要求苛刻，大多数差异甲基化基因的组内变异较大、判别能力有限，但通过筛选关键位点构建的鉴别体系具有较高的判别准确率，并且重复性、重现性、灵敏度和通用性良好。研究还发现不同肌肉的判别能力存在差异，建议在法医学实践中优先选择大肌肉样本。然而，该研究也存在一定局限性，如肌肉组织易受环境因素影响而降解，可能会影响 DNA 质量。未来研究需要采用更严格的实验设计和标准化的样本处理程序，以减少这些干扰因素的影响。总体而言，该研究为野生动物保护执法提供了有力的技术支持，也为其他物种的鉴别方法开发提供了重要参考，在野生动物保护领域具有重要的理论和实践意义。