探秘朱鹮胚胎死亡之谜：大肠杆菌与奇异变形杆菌的 “双重威胁”

为探究朱鹮胚胎死亡与细菌感染的关系及菌株耐药性和毒力的关联性，研究人员对死亡朱鹮胚胎中的大肠杆菌（E. coli）和奇异变形杆菌（P. mirabilis）进行研究。结果显示，菌株具致病性、耐药性且存在基因共转移，这为朱鹮保护提供重要依据。

　　朱鹮，作为世界上最为濒危的鸟类之一，曾广泛分布于东亚地区，然而在 20 世纪，由于过度捕猎、栖息地丧失以及农药的使用，其种群数量急剧下降。1981 年，在中国陕西洋县发现了仅存的 7 只野生朱鹮。此后，中国政府采取了一系列保护措施，朱鹮的种群数量和分布范围才逐渐有所恢复。但即便如此，朱鹮的生存依旧面临着诸多严峻挑战，其中胚胎死亡率居高不下成为了最为紧迫的问题之一。

在禽类养殖领域，细菌感染一直被视为导致胚胎死亡的主要原因之一，常见的致病菌包括大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、葡萄球菌属以及变形杆菌属等。这些细菌能够侵入蛋黄，最终致使胚胎死亡。大肠杆菌和奇异变形杆菌作为常见的革兰氏阴性菌，广泛存在于人和动物的胃肠道以及环境（如土壤、水和污水等）中。致病性菌株可引发肠道或肠道外疾病。此前有研究表明，大肠杆菌是导致雏鸡卵黄囊感染、脐炎和早期死亡的主要原因之一，而奇异变形杆菌则与禽类的繁殖失败有关。

目前，在临床实践中，抗菌药物是预防和治疗细菌疾病的主要手段。然而，由于抗菌药物的广泛使用以及通过移动元件（如质粒、整合子、插入序列、接合转移元件等）进行的水平基因转移，导致了包括产生超广谱 β - 内酰胺酶（ESBLs）、AmpC 酶、碳青霉烯酶等多种耐药机制的多重耐药菌株不断涌现，使得感染的治疗愈发困难。

为了解决朱鹮胚胎高死亡率的问题，探究大肠杆菌和奇异变形杆菌与胚胎死亡的潜在联系，以及菌株耐药性和毒力之间是否存在关联，四川农业大学的研究人员开展了此项研究。研究结果表明，大肠杆菌和奇异变形杆菌是导致朱鹮胚胎死亡的重要因素。这些菌株普遍存在抗菌耐药性，其中对阿莫西林、头孢唑林、土霉素和复方新诺明的耐药率较高，且超过 30% 的菌株表现出多重耐药性（MDR）。同时，研究还检测到多种毒力基因和 ESBL 基因，部分基因的携带率较高，并且发现了耐药基因和毒力基因的共存在及共转移现象。这一研究成果对于朱鹮的人工繁育和保护具有重要意义，为制定针对性的防控措施提供了科学依据。该论文发表在《Avian Research》杂志上。

研究人员在开展研究时，运用了多种关键技术方法。首先是样本采集与细菌鉴定技术，在 2020 年 4 月至 2021 年 4 月期间，从中国四川峨眉山生物资源与实验站基地收集了 23 份死亡朱鹮胚胎样本，通过解剖取肝脏样本，经革兰氏染色、标准生化测试和 16S rDNA PCR 测序鉴定细菌种类。其次是致病性评估技术，用分离菌株腹腔注射小鼠，观察小鼠死亡情况来判断菌株致病性。此外，采用肉汤微量稀释法进行抗菌药敏试验，检测菌株对多种抗菌药物的敏感性。通过 PCR 测序技术检测 ESBL 基因和毒力基因，利用质粒结合实验评估基因的转移能力，最后运用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术对菌株进行分子分型。

下面详细介绍研究结果：

• 尸检、细菌学和致病性检查：对死亡胚胎解剖发现其体型小、脚趾卷曲、卵黄囊发炎、卵黄吸收不良，部分体表有出血点。细菌学检查成功分离出 13 株大肠杆菌和 12 株奇异变形杆菌，部分样本同时含有这两种细菌。小鼠致病性评估显示，感染小鼠出现抑郁、厌食、眼炎等症状，72 小时内全部死亡，解剖可见肺部轻微出血、器官肿胀等，而对照组无异常，证实了所有菌株的致病性。
• 抗菌药敏试验：所有分离菌株至少对一种抗菌药物耐药，对阿莫西林、头孢唑林、土霉素和复方新诺明的耐药率较高，46.15% 的大肠杆菌和 33.33% 的奇异变形杆菌为多重耐药菌株。
• ESBLs 耐药基因和毒力基因检测：PCR 测序结果显示，所有菌株均携带bla_{TEM - 1}基因，大肠杆菌中bla_{CTX - M - 55}、bla_{CTX - M - 14}等基因的携带率也较高，奇异变形杆菌中bla_{CTX - M - 55}等基因有一定携带率，且均未检测到bla_SHV和bla_OXA基因。大肠杆菌中检测到 4 种毒力基因，irp2和iucD的携带率为 100%，fimC和iss为 92.31%；奇异变形杆菌仅检测到ucaA（58.33%）。多数菌株同时存在 ESBL 和毒力基因。
• β - 内酰胺耐药表型、ESBLs 基因和毒力基因之间的关联：相关性分析表明，大肠杆菌中 β - 内酰胺耐药与 ESBLs 基因存在弱或中度正相关，与毒力基因多为负相关；奇异变形杆菌中 β - 内酰胺耐药与耐药基因多为中度或强正相关，ESBLs 基因与ucaA为负相关。
• ESBLs 和毒力基因的转移能力：结合实验成功获得大肠杆菌和奇异变形杆菌的多个接合子，PCR 测序显示多种基因发生转移，药敏试验表明接合子耐药性显著提高，且供体菌和接合子的多重耐药率无显著差异。
• PFGE 分析：PFGE 分析将 13 株大肠杆菌分为 10 个簇，12 株奇异变形杆菌分为 7 个簇，菌株间遗传变异较大。部分相似 PFGE 模式的菌株具有不同的耐药表型和基因型，不同 PFGE 模式的菌株却携带相似的耐药基因，提示可能存在水平基因转移。

综合研究结论和讨论部分，大肠杆菌和奇异变形杆菌是导致朱鹮胚胎死亡的重要病原菌，其耐药性广泛存在，ESBL 基因和毒力基因在许多菌株中共存且可水平转移。尽管 ESBL 耐药基因与毒力基因多呈负相关，但基因的转移仍可能产生大量耐药和高毒力菌株，导致临床治疗失败和高死亡率。因此，在朱鹮繁育基地，严格的生物安全措施、谨慎使用抗菌药物以及长期监测细菌耐药性和致病性至关重要，这对于保护朱鹮种群、推动其人工繁育工作具有不可忽视的意义。