1. 引言
鸟类作为生态系统生物多样性的重要组成部分，在维持生态系统功能方面发挥着独特作用，如通过种子传播、授粉和捕食昆虫来促进动植物群落的稳定。传统鸟类监测方法，像点抽样、样线调查、捕获标记和自动录音等，主要依赖视觉或听觉调查，但这些方法常受环境条件限制，例如黄昏时能见度低、植被茂密、雾霾等恶劣天气以及环境噪音干扰。此外，它们对物种鉴定的专业要求较高，且结果易受调查人员技能和环境条件影响。
环境 DNA（eDNA）技术为克服传统监测方法的局限性提供了新途径。eDNA 是生物体通过皮肤细胞、粪便、配子、分泌物等生物材料释放到环境中的 DNA 片段。携带 eDNA 的环境样本包括水、土壤、沉积物、粪便甚至空气。该技术通过从环境样本中提取 DNA，利用聚合酶链反应（PCR）进行扩增，再借助高通量测序进行测序分析，从而识别目标生物。eDNA 技术应用广泛，可用于监测特定的稀有濒危物种，也能评估整体生物多样性。与传统方法相比，它具有高效、快速、非侵入性、环保和标准化流程等优点。
eDNA 技术在众多生物类群监测中都有应用，如鱼类、两栖类、植物、微生物和鸟类等。不过，其在不同物种监测中的有效性存在差异，这受目标生物生物学特性、eDNA 分布的时空异质性以及环境条件等因素影响。尽管面临挑战，eDNA 在鸟类监测方面还是受到了越来越多的关注。
目前已有不少关于 eDNA 监测鸟类多样性的研究。比如，Ushio 等人利用改良的鱼类 / 哺乳动物通用引物在动物园和自然环境中检测多种鸟类，证明了 eDNA 在评估鸟类多样性方面的潜力；Katayama 等人运用 eDNA 宏条形码技术监测稻田繁殖季节的鸟类物种；Sohn 和 Song 则评估了城市生态公园鸟类多样性的季节变化。但鸟类多样性监测常被纳入针对其他分类群的 eDNA 生物多样性监测中，如城市地区的脊椎动物、湿地生物以及淡水和陆地生态系统生物等。
在整体多样性监测中，与传统调查相比，目前 eDNA 通常检测到的鸟类物种较少。例如，一些研究中 eDNA 技术检测到的鸟类物种数量远低于视觉调查。与传统相机陷阱相比，土壤和水中的 eDNA 检测到的鸟类物种也明显更少，但能识别出某些仅被 eDNA 捕获的物种。而空气 eDNA 不仅能检测到相机捕捉到的所有鸟类物种，还能揭示出比相机陷阱更多的物种多样性。不过，由于空气 eDNA 含量较低，其技术的有效性和机制还需更多应用来验证，并且利用 eDNA 宏条形码技术确定整个鸟类群落的丰度信息仍是一个挑战。
在物种特异性监测方面，虽然针对稀有濒危鸟类的 eDNA 研究有限，但现有研究已显示出其高效性。比如，Neice 和 McRae 利用 eDNA 检测全球濒危的黑脸田鸡（Laterallus jamaicensis），在水和土壤样本的 eDNA 中检测到该物种的比例为 47%，而传统的听觉和视觉调查仅为 2%；Day 等人开发了针对濒危的胡锦雀（Erythrura gouldiae）的 eDNA 检测方法，能在小体积水样（20 - 200 μL）中检测到该物种，且特异性高；Guan 等人成功将 eDNA 应用于监测长嘴秧鸡（Rallus obsoletus）；Schuetz 等人利用该技术检测到了三种欧洲鸟类（白琵鹭Platalea leucorodia、反嘴鹬Recurvirostra avosetta和普通鹬Tringa tetanus）。这些研究表明 eDNA 能够检测到传统方法难以发现的低种群密度的隐秘物种。
尽管 eDNA 技术在鸟类监测方面潜力巨大，但该领域仍处于起步阶段。本文旨在全面分析 eDNA 在鸟类监测中的应用现状，找出关键挑战，并规划未来研究方向，以促进 eDNA 技术在鸟类研究中的有效整合。
2. 鸟类 eDNA 技术的关键步骤
2.1 样本采集、eDNA 捕获和保存
鸟类生活在多样的生态系统中，包括湿地、森林、草原和城市公园等，这使得 eDNA 的来源也多种多样，如水、沉积物、土壤、空气，甚至蜘蛛网和花朵。有效的鸟类 eDNA 采样策略必须考虑到这些不同的来源。
水是鸟类 eDNA 的主要来源之一，因为鸟类频繁接触水生环境。不同分类群和生活方式的鸟类，其 eDNA 在水中的检测概率有所不同。例如，水鸟在水中的 eDNA 可检测性高于森林鸟类，这是因为水鸟的生活史更依赖水。过滤是从水样中捕获 eDNA 的标准方法，水样体积通常在 100 μL 到 5 L 之间。常用的过滤器有混合纤维素酯、玻璃纤维、硝酸纤维素过滤器和 Sterivex 过滤器，孔径在 0.22 μm 到 1.2 μm 之间。较大的水样体积可能会提高对低浓度 eDNA 的检测灵敏度。此外，静水水体比流水系统的检测率更高，这在采样时需要重点考虑。
在沉积物和土壤中，由于沉积和扩散受限，eDNA 分布往往不均匀且局部化，导致样本间物种检测率存在差异。因此，采用综合采样策略，如多点混合采样，可以提高检测率，尤其是对于可检测性低或分布不均匀的物种。
空气 eDNA 是鸟类监测的一项重要进展，目前研究中其检测率最高。采集空气 eDNA 需要专门的空气采样器，可使用水、玻璃纤维过滤器、涂有凡士林的胶带或定制设计的材料来捕获颗粒。这些采样器可以安装在树上或开阔空间进行连续采样。鸟类与采样器的距离越短，检测概率越高，但需要避免恶劣天气条件，以确保自动采样的有效性。
蜘蛛网和花朵等自然被动生物过滤器为实验采样提供了独特的机会。这些材料几乎无需预处理，就能有效捕获鸟类 eDNA。同时，玻璃纤维过滤器等商业吸附材料也可用作人工被动采样器来采集水 eDNA。
环境因素，如温度、紫外线（UV）、pH 值和盐度等会影响 eDNA 的稳定性，在采样时应记录这些因素，以便准确解释结果。由于 eDNA 易降解，样本保存至关重要。样本应在冰上运输并及时处理（如过滤水样），并储存在 -20°C 或更低温度下。如果条件允许，现场过滤能更好地保存 eDNA，但需要在避风、防尘和避光的环境中进行。过滤器应暂时冷冻保存，直至进行 DNA 提取，同时要避免反复冻融循环。
2.2 DNA 提取
由于鸟类 eDNA 浓度通常极低，在 DNA 提取过程中尽量减少污染至关重要。设备和材料必须用次氯酸钠消毒，次氯酸钠是一种有效的消毒剂，可防止 DNA 和 PCR 产物污染。商业试剂盒，如 QIAGEN 血液和组织试剂盒，常用于鸟类 eDNA 提取。实际操作中，解剖滤膜和延长消化时间等调整措施可以提高 DNA 产量。为减少环境样本中腐殖酸等 PCR 抑制剂的影响，可以使用抑制剂去除试剂盒（如 OneStep PCR Inhibitor Removal Kit）或对样本进行稀释。同时，设置阴性对照，包括空白过滤和提取对照，对于检测污染至关重要。提取的 DNA 应储存在 -20°C 或更低温度下，以备后续分析。
2.3 引物设计和选择
物种特异性检测依赖于设计用于扩增目标物种特有短 DNA 序列的引物。相比之下，通用引物旨在检测单个分类群内的多个物种。有效的通用引物应在广泛检测和最小化扩增偏差之间取得平衡，以避免假阴性或假阳性结果。
线粒体 12S rRNA 基因在鸟类 eDNA 研究中应用广泛，因为它能够在物种水平进行鉴定，且序列较短，适合降解的 eDNA 样本。例如，Ushio 等人开发的 MiBird-U 通用引物组专门用于鸟类物种检测，此后被广泛应用。其他针对 12S 区域的引物，如 12SV05、Tele02 等，尽管最初是为其他分类群设计的，但也成功检测到了鸟类物种。
COI 区域也是常见的目标区域，广泛用于鸟类物种特异性监测。有趣的是，在一项监测脊椎动物多样性的研究中，研究人员使用针对哺乳动物的 16Smam 引物（对应 16S 区域）和针对啮齿动物的 L15411F 和 H15546R 引物（对应cytb区域），成功检测到了一百多种鸟类。不过，对于特定的鸟类 eDNA 监测，针对特定鸟类群体或独特基因的引物可以提高检测灵敏度和分辨率。
2.4 测序和数据分析
宏条形码技术通过向 PCR 产物添加接头，对 eDNA 进行下一代测序。通过操作分类单元（OTU）聚类，并与生命条形码数据库系统（BOLD）或美国国家生物技术信息中心（NCBI）等参考数据库进行比对，实现分类学分类。
公共数据库提供了便捷的参考，但可能存在质量控制和覆盖范围不足的问题。定制数据库则允许研究人员验证序列质量，提高鉴定准确性。扩大公共和私人数据库中的鸟类 DNA 条形码，将进一步提升基于 eDNA 的监测能力。
3. 鸟类 eDNA 技术的量化水平及其影响因素
3.1 鸟类 eDNA 技术的量化水平
目前，鸟类 eDNA 技术只能检测物种组成，无法精确量化自然界中鸟类的丰度。这一挑战并非鸟类研究特有，在鱼类、两栖类和浮游动物等物种的 eDNA 研究中也存在。建立物种丰度与 qPCR 拷贝数以及相对测序读数计数之间的确切关系，仍是当前研究的重点。
近期一项空气 eDNA 研究检测到了多达 113 种鸟类，但大多数鸟类 eDNA 研究检测到的物种数量要少得多，通常只有几种到几十种。此外，每个 eDNA 样本检测到的物种数量往往有限，这就需要大量样本，从而增加了成本。这种差异凸显了基于 eDNA 的鸟类多样性调查中持续存在的假阴性问题。鸟类 eDNA 的可检测性受其在环境中的产生、运输和降解等因素影响。
3.2 eDNA 产生
鸟类 eDNA 通过尿液、粪便、羽毛和唾液等释放到环境中，这与鸟类的生理特征，如羽毛覆盖和皮肤角质层有关。生物量、个体大小、行为和新陈代谢等因素对 eDNA 产生有显著影响。
较高的生物量（鸟群的总体重）与在水和空气中 eDNA 的检测频率增加相关。高生物量通常与较大的个体体型或较多的个体数量有关，这意味着 DNA 产生和沉积增加，进而检测率也更高。不过，这些关系因物种而异，反映了不同物种在行为和生理上的差异。深入了解鸟类 eDNA 产生与这些因素的关系，有助于优化采样策略和种群评估。
3.3 eDNA 运输
eDNA 释放后，会通过环境介质进行运输，这影响了其在时空上的可检测性。影响 eDNA 运输的关键因素包括介质类型（如水、空气、土壤）、天气 / 气候条件以及人类干扰。
在水生环境中，水流（静水或流水）、坡度和底物类型对 eDNA 运输有显著影响。例如，eDNA 在河流中通常传播距离在 2 km 以内，而静水水体有利于 eDNA 的积累。
在空气中，风速、风向和降雨会影响 eDNA 的扩散。空气 eDNA 的空间分布不均匀且稀疏，增加了检测难度。在鸟类迁徙期间，迁徙路线上的 eDNA 浓度会增加，降雨等天气条件可能会将空气中的颗粒物冲刷掉，而当环境干燥时，这些颗粒物可能再次扬起并运输。
在土壤或沉积物中，eDNA 的移动性较差，这为检测提供了更高的空间精度。然而，eDNA 在这些介质中的随机和局部化分布，需要进行广泛采样。人类活动，如疏浚，会显著改变这些环境中 eDNA 的运输。
eDNA 运输可能会稀释目标 eDNA 浓度，降低检测性。目前，eDNA 释放和扩散的详细动态仍有待进一步研究和探索。了解 eDNA 在不同环境条件下的运输和扩散情况，对于利用 eDNA 技术准确估计鸟类物种的时空分布至关重要。
3.4 eDNA 降解
eDNA 在环境中的降解与物种无关，但鸟类 eDNA 丰度较低会加速其降解。它受生物和非生物因素影响，包括微生物活动、核酸酶、温度、pH 值和紫外线辐射。
微生物活动和细胞外核酸酶在 eDNA 降解中起关键作用。溶解的 DNA 是微生物的营养来源，微生物通过水解代谢 DNA。微生物对营养物质的季节性响应会影响海洋环境中 eDNA 的持久性。细胞外核酸酶直接将游离 DNA 降解为较小片段，在稳态条件下，可使 eDNA 在沉积物中的停留时间缩短至几个月。在土壤中，细菌 DNA 酶是 DNA 降解的主要原因，因为土壤细菌会积极分泌核酸酶。
高温会加速 eDNA 降解，在水生环境中尤为明显，不过土壤条件可能会减轻温度的影响，延长 eDNA 的持久性。pH 值对 eDNA 降解也有显著影响，中性或弱碱性条件有利于 eDNA 的稳定。紫外线会直接损伤 DNA，或通过活性氧诱导氧化应激。紫外线的影响在高海拔或赤道地区更为明显，但其与 eDNA 降解的关系是非线性的。此外，紫外线还可以抑制微生物降解，从而增强 eDNA 的持久性。
水中的营养状况会影响 eDNA 降解，降解速率与溶解有机碳浓度呈负相关。腐殖质可以通过结合游离 DNA 来减缓 eDNA 降解，保护其免受酶解，尽管腐殖质可能会抑制 PCR 反应。
虽然目前对 eDNA 降解因素的了解有限，但研究表明 eDNA 降解速度很快。这些因素对于优化采样方案至关重要。
4. 环境 RNA
基于 eDNA 技术，环境 RNA（eRNA）具有独特且互补的优势。与 DNA 不同，RNA 仅来源于活跃转录的基因，能够区分活的和死的生物体。这一特性使 eRNA 比 eDNA 更敏感，预测价值更高，能有效减少假阳性，增强对活跃的实时生物过程的监测。此外，eRNA 的降解速度比 eDNA 更快，其阳性检测结果与特定的时间和空间背景更紧密相关，因此具有更强的局部信号，提高了时空分辨率。
eRNA 能提供丰富的潜在生态信息。与鱼类相比，eRNA 宏条形码技术检测到的鸟类物种数量比 eDNA 更多，从而使整体物种数量增加。除了检测物种组成，eRNA 还可以评估个体的生理状态、种群的生态健康状况和群落动态。这些功能指标揭示了生态系统中种群或群落的状态。例如，eRNA 有潜力检测物种的不同生活史阶段、性别，甚至特定表型，这超越了目前 eDNA 在分类学上的限制。此外，分析 RNA 表达可以揭示生物体对环境压力的反应，使其成为评估化学危害、环境污染或预测不适宜栖息地的有效工具。
eRNA 和 eDNA 数据在检测分类群方面具有很强的互补性。将 eRNA 与 eDNA 相结合，能够更深入地了解生物体水平的变化如何转化为生物多样性模式。这种整合有助于更精确地捕捉动态生态变化，为鸟类监测提供更丰富的信息。然而，eRNA 宏条形码技术作为常规监测方法的潜力尚未完全实现。在优化采样和分析程序，提高 eRNA 在生态研究中的实用性和可靠性方面，仍存在显著差距。进一步的探索和方法改进对于充分发挥 eRNA 的潜力至关重要。
5. 未来展望
与传统方法相比，eDNA 技术在整体生物多样性监测中存在检测鸟类物种较少、无法量化丰度的问题，这是由于技术尚不成熟，存在假阴性和假阳性等问题。而传统方法则耗时、费力，且易受人为因素影响。相比之下，eDNA 技术作为一种新兴的调查方法，虽处于起步阶段，但在鸟类监测方面潜力巨大。为推动 eDNA 技术在鸟类监测中的应用，未来研究应重点关注以下几个方面：
- 优化采样策略：通过改进过滤材料、孔径和针对特定环境的采样方案，提高鸟类 eDNA 的捕获效率。
- 开发鸟类特异性通用引物：设计针对特定分类亚群的引物，减少引物偏差，提高检测准确性。
- 扩大鸟类 DNA 条形码数据库：建立全面、高质量的参考文库，增强 eDNA 分析的可靠性。
- 提高痕量 eDNA 的检测限：开发在环境噪音中检测痕量鸟类 eDNA 的方法，应对生物和非生物降解因素。
- 实现 eDNA 在量化鸟类丰度方面的有效性：突破技术障碍，准确量化鸟类丰度。
- 整合 eDNA 和 eRNA：根据具体研究需求，选择单独研究 eDNA 或 eRNA，或同时研究二者。
6. 结论
eDNA 技术在监测稀有濒危鸟类物种和鸟类多样性方面的潜力显而易见。基于 eDNA 的鸟类监测包括样本采集、DNA 提取、PCR 扩增、测序和数据分析五个关键步骤。然而，由于样本类型（如水、空气、土壤、沉积物）、样本体积（如水样 100 mL - 5 L）、过滤器类型（如混合纤维素酯、玻璃纤维、硝酸纤维素过滤器和 Sterivex 过滤器）、滤孔大小（通常在 0.22 μm 到 1.2 μm 之间）、遗传目标选择（如 12S、COI）和引物选择等方面存在差异，不同研究之间存在异质性，这阻碍了标准化 eDNA 协议的建立。不同鸟类物种的独特生物学特征、不同环境的独特理化性质以及时空异质性，要求不断完善和
