基于高分辨质谱与荧光检测的DMB标记唾液酸双重分析技术突破及其在糖生物学中的应用

本研究针对唾液酸(Sia)结构多样性导致的质谱鉴定难题，开发了基于1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯(DMB)标记的高效液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)联用技术。通过优化CAPCELL CORE C18色谱柱分离条件，成功解析牛颌下腺黏蛋白(BSM)中14种唾液酸异构体（包括新型Neu5Gc7,8,9Ac3），建立碰撞诱导解离(CID)特征离子集诊断体系，实现32 fmol级检测灵敏度。该研究为糖基化修饰研究提供了双重验证的分析新范式。

　　

在糖生物学研究领域，唾液酸(Sialic acids, Sia)作为九碳单糖家族的重要成员，其结构多样性给分析检测带来巨大挑战。这些带负电的糖分子不仅存在于高等动物复杂聚糖的末端位置，也出现在某些病原微生物表面，通过N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)和脱氨神经氨酸(Kdn)三种基本形式，以及磷酸化、硫酸化、甲基化和O-乙酰化等多种修饰参与免疫调控、病原体识别等关键生物学过程。然而，现有分析方法面临三大瓶颈：传统荧光标记法难以区分结构异构体；质谱检测受限于O-乙酰基的位置异构；电子活化解离(EAD)技术在糖类分析中的应用尚未成熟。

为突破这些技术壁垒，日本研究团队在《BBA Advances》发表创新性研究成果。该工作建立了一套整合荧光检测与高分辨质谱的双重验证系统，通过优化DMB(1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene)标记策略和色谱分离条件，结合ZenoTOF 7600质谱仪的碰撞诱导解离(CID)与电子活化解离(EAD)双模式，实现了唾液酸结构解析的技术革新。关键技术包括：采用CAPCELL CORE C18色谱柱建立90分钟梯度洗脱程序；开发高灵敏度sMRM^HR定量方法；系统比较CID与EAD的碎片模式差异；应用2M丙酸温和水解保持O-乙酰基完整性。

在结果部分，"BSM和标准唾液酸的荧光检测与质谱分析"显示，研究团队成功分离出BSM中14种DMB标记的唾液酸异构体，包括首次报道的Neu5Gc7,8,9Ac₃三乙酰化变体。通过建立相对保留时间(RRT)数据库和特征离子集（如Neu5Ac特异的m/z 126.055、168.066碎片），实现了对C5位修饰的精准判别。灵敏度测试表明荧光检测限达320 amol，较质谱定量灵敏度提高100倍。

"CID碎片分析"章节揭示了关键诊断离子规律：Neu5Ac系列产生m/z 126.055（C₆H₈NO₂⁺）、168.066等C5-N-乙酰基特征碎片；Neu5Gc则生成m/z 142.050、184.060等羟乙酰基特征离子。这些碎片模式为区分结构异构体提供了"分子指纹"，特别对7,8,9位O-乙酰化定位具有指示意义。

在"EAD碎片研究"中，虽然16 eV动能下电子束主要裂解DMB荧光核心（产生m/z 91.054苯甲基离子），未能有效获取糖环结构信息，但为后续金属离子辅助的电子转移解离(ETD)研究提供了技术参照。研究者指出，未来可通过碱金属加合策略增强糖苷键断裂效率。

该研究的结论部分强调了三重创新价值：首先，建立的DMB-Sia分析方法比传统GC-MS提升两个数量级检测灵敏度；其次，发现的C5位诊断离子体系为无标准品条件下的结构推定提供新依据；最后，双检测模式（荧光定量+质谱定性）为糖组学研究建立了可靠范式。特别值得注意的是，在BSM中鉴定到的Neu5Gc7,8,9Ac₃拓展了对唾液酸O-乙酰化修饰多样性的认知，为研究唾液酸在病原体逃逸宿主免疫中的功能机制提供了新的分析工具。这项技术突破不仅适用于基础研究，在癌症生物标志物筛查、疫苗开发等应用领域同样具有重要价值。