基于SALSA技术的唾液酸化亚糖异构体全糖组学分析进展及其在生物标志物探索中的应用

本文综述了整合糖组学(SALSA)技术的最新进展，重点介绍了唾液酸连接特异性烷基酰胺化(SALSA)方法在区分唾液酸化糖链异构体中的应用，开发了自动化糖鞘脂糖链制备系统，并通过人血清和小鼠脑组织的全糖组分析，揭示了不同糖缀合物亚糖组的特异性表达模式，为探索糖链作为生物现象的有效标志物提供了新思路。

　　

糖链作为细胞表面的"糖衣"，是继核酸、蛋白质和脂质之后的第四类重要生物分子。这些复杂的碳水化合物通过糖蛋白、糖脂等形式覆盖在真核细胞表面，在细胞间识别、信号传导等生命过程中扮演关键角色。然而，由于糖链结构的极端复杂性——特别是含有唾液酸(Neu5Ac)的糖链存在α2,3-、α2,6-和α2,8-等多种连接方式的异构体，传统分析方法难以实现全面、准确的糖组解析。这一技术瓶颈严重制约了糖科学在疾病标志物发现和功能研究中的应用。

日本多个研究机构的研究团队在《BBA Advances》发表综述，系统介绍了整合糖组学分析的最新进展。研究团队开发了创新的唾液酸连接特异性烷基酰胺化(SALSA)技术，结合自动化糖链制备系统，实现了对唾液酸化糖链异构体的精准分析。通过对人血清和小鼠脑组织的全糖组分析，研究人员不仅揭示了不同糖缀合物亚糖组的特异性表达模式，还发现了17种可能作为干细胞标志物的新型糖链结构。这项工作为糖组学在生物标志物探索中的应用开辟了新途径。

关键技术方法包括：1) 唾液酸连接特异性烷基酰胺化(SALSA)技术，通过氨基解实现唾液酸连接方式的区分；2) 自动化糖鞘脂(GSL)糖链制备系统，实现96样本/16小时的高通量处理；3) 改进的碱性β-消除吡唑酮标记(BEP)方法，用于O-糖链的高效释放；4) 基于MALDI-TOF MS和HPLC的多维分析平台。样本来源于18种人细胞系(含4种胚胎干细胞和5种诱导多能干细胞)以及人血清和小鼠脑组织。

【Sialic acid derivatization of N-glycans, GSL-glycans, fOSs, and O-glycans to distinguish sialyl glycan isomers】
研究团队开发的SALSA技术通过氨基解反应，将不同连接方式的唾液酸分别转化为异丙基酰胺(α2,3连接)和甲基酰胺(α2,6连接)，实现了唾液酸化糖链异构体的质谱区分。该方法克服了传统甲基酯化法的定量限制，灵敏度显著提高。特别值得注意的是，针对O-糖链分析的技术难题，研究人员创新性地在糖蛋白水平直接进行SALSA修饰，再通过温和的BEP方法释放糖链，成功避免了环状GalNAc还原端与唾液酸的分子内内酯化干扰。

【Automated glycan preparation for MALDI-TOF MS analysis】
为实现大规模糖组分析，研究团队开发了自动化糖链制备系统。该系统整合了8通道多注射器、恒温反应室和正压纯化单元，可自动完成酶解、SALSA反应、固相萃取等步骤，并能直接点样至MALDI靶板。针对糖鞘脂(GSL)含量低的特点，系统特别优化了乙醇沉淀除蛋白步骤，确保低丰度GSL糖链的回收率。该系统处理96个人血清样本仅需16小时，大大提高了糖组分析的通量和重复性。

【Total glycomics】
应用改进的全糖组分析方案，研究人员对人血清和小鼠脑组织进行了系统分析。在人血清中鉴定出128种糖链结构(86种N-糖链、22种GSL糖链、11种O-糖链、6种GAG二糖和3种游离寡糖)，较2016年报道的数量增加40%。通过五边形图示法直观展示了不同亚糖组的相对含量和结构特征。小鼠脑组织分析则发现164种糖链，其中糖鞘脂占比显著高于血清，反映了脑组织特异的糖链组成模式。特别值得注意的是，脑组织中检测到含有α2,8连接唾液酸的双/三唾液酸T抗原，这些结构在血清中未见表达。

这项研究通过技术创新解决了糖组学分析中的多个关键难题。SALSA方法首次实现了对所有类型唾液酸化糖链(包括长期难以分析的O-糖链)连接异构体的区分，质谱检测灵敏度提高了一个数量级。自动化制备系统的开发使大规模糖组分析成为可能，为人类糖组图谱计划的实施提供了技术保障。全糖组分析揭示的不同组织特异的糖链表达谱，不仅深化了对糖生物学功能的认识，更为疾病标志物的发现提供了新思路。特别是在干细胞研究中发现的17种差异表达糖链，展现出作为新型细胞标志物的潜力。这项工作标志着糖组学分析从单一糖类研究向系统糖生物学研究的转变，为探索糖链在生命过程和疾病发生中的作用提供了强有力的工具。