综述：GMP级基因与细胞治疗用生物药物的质量评估策略开发与分析方法选择

这篇综述系统阐述了基因与细胞治疗领域生物药物（如重组蛋白、病毒载体、CAR-T细胞等）的GMP质量控制（QC）策略，强调基于质量源于设计（QbD）理念的个性化评估方案，涵盖纯度、效价（EC50/TCID50）、稳定性等关键质量属性（CQA），为复杂生物制品的标准化生产提供方法论指导。

　　

引言

随着生物医学的快速发展，基因与细胞治疗药物（如重组蛋白、病毒载体、CAR-T细胞等）已成为攻克难治性疾病的新希望。这类药物结构复杂，需通过特定生物反应器（如真核/原核细胞工厂）生产，并经历多步纯化以去除宿主蛋白、DNA等杂质。其质量控制（QC）需根据药物特性定制，涉及鉴定、浓度测定、杂质检测、效价评估等关键环节，且分析方法常存在批次间差异大、成本高等挑战。

关键质量评估要素

纯度

药物纯度分为生产相关杂质（如宿主细胞蛋白、内毒素）和药物自身缺陷（如空病毒颗粒）。原核系统生产的重组蛋白需重点去除内毒素和细菌DNA，而真核系统产物（如AAV载体）需清除宿主细胞碎片、残留抗生素等。CAR-T细胞产品则需控制非功能细胞比例（<5%）。

药物鉴定与定量

• 病毒载体：AAV衣壳蛋白（VP1/VP2/VP3）的抗体检测易受构象影响，需结合qPCR（定量聚合酶链反应）与动态光散射（DLS）分析空/满颗粒比例。
• 质粒DNA：超螺旋构型占比需>95%（HPLC分析），残留宿主DNA应<10 ng/剂量。
• 细胞产品：CAR-T细胞需通过流式细胞术确认ScFv表达，干细胞需监测多能性标志物（如OCT4、SOX2）的mRNA表达谱。

效价测定

效价反映药物生物学活性。例如：

• 病毒载体：通过感染靶细胞测定TCID₅₀或基因表达效率（RT-qPCR）。
• CAR-T细胞：需评估抗原刺激后的增殖指数、细胞因子释放谱及体内肿瘤杀伤效果（SCID小鼠模型）。
• 缺陷补偿策略：若缺乏直接效价检测法，可组合分析超速离心（AUC）、电镜（EM）和基因组完整性（多片段qPCR）数据。

稳定性

生物药物对pH、温度敏感。例如：

• 病毒载体需监测存储期间的聚集倾向（SLS/DLS技术）。
• 细胞产品需验证冻融后存活率（>95%）及功能稳定性。

安全性

风险包括：

• 微生物污染：需通过14天培养法确认无菌，内毒素限值<0.05 EU/mL。
• 免疫原性：病毒载体可能触发中和抗体，异体细胞易引发GVHD（移植物抗宿主病）。
• 致瘤性：iPSC产品需通过裸鼠成瘤实验和全基因组测序排除致癌风险。

质量控制策略开发

常规检测

所有生物药物需满足药典标准（USP/Ph.Eur.），包括外观、pH（6-8）、渗透压（280-330 mOsm/L）等。新兴技术如数字PCR（ddPCR）可提高病毒基因组定量准确性，而"Stunner"系统整合UV/DLS实现AAV颗粒快速分析。

质粒产品

• 宿主残留：ELISA检测E.coli蛋白（<1%），qPCR靶向16S rRNA基因监控DNA污染。
• 结构完整性：毛细管电泳（CE）分析超螺旋比例，限制性酶切验证插入序列正确性。

病毒载体

• 空壳率：电镜与AUC联用区分空/满AAV颗粒。
• 宿主DNA风险：设计>200 bp的qPCR引物（如Alu元件）排除功能性基因污染。

细胞治疗产品

• 细胞特性：CAR-T细胞需CD3⁺/CAR⁺占比>90%，干细胞通过3D培养评估分化倾向。
• 肿瘤风险：核型分析结合SCID小鼠模型验证iPSC安全性。

结论

生物药物QC需综合分子特性、生产工艺与分析方法局限性。未来需持续优化检测技术（如质谱成像、单细胞测序），以应对AAV空壳率、CAR-T细胞异质性等挑战，推动个性化医疗的标准化进程。