创新甲基化质谱法：精准剖析寡聚 / 多聚唾液酸结构的关键钥匙

寡聚 / 多聚唾液酸（oligo/polySia）结构检测困难，研究人员开展基于甲基化的串联 MALDI-TOF 质谱检测方法研究。成功检测并区分 α2,8 - 和 α2,9 - 连接的 polySia，还分析了鲑鱼卵多糖唾液酸糖蛋白（PSGP）中 oligo/polySia 结构，为相关研究提供有效手段。

　　在生命科学的微观世界里，糖链作为蛋白质的重要 “伙伴”，承担着诸多关键角色。大约 50% 到 80% 的蛋白质都有糖链的修饰，它们参与着蛋白质的折叠、定位以及细胞间的识别等过程，部分糖链更是疾病的重要生物标志物。然而，与研究较为成熟的核酸和蛋白质相比，糖链的研究进展却十分缓慢。这主要是因为糖链结构复杂多样，其分析难度极大。

在众多糖链中，寡聚 / 多聚唾液酸（oligo/polySia）是一类由唾液酸（Sias）组成的线性聚合物，广泛存在于从细菌到脊椎动物各类生物的聚糖非还原末端。不同类型的 oligo/polySia 在 Sia 组成、α- 酮糖苷键连接方式以及聚合度（DP）等方面都存在差异。目前，检测 oligo/polySia 的方法虽然有蛋白质免疫印迹法（Western blotting）、酶联免疫吸附测定（ELISA）等，但这些方法存在局限性。质谱（MS）分析本是强大的检测手段，可 oligo/polySia 的多个负电荷和结构不稳定性使得质谱检测困难重重。正因如此，开发一种高灵敏度的基于质谱的完整 oligo/polySia 结构检测方法迫在眉睫。

国外研究人员为了解决这一难题，开展了深入研究。他们运用甲基化技术，将 Sias 的羧基转化为甲酯，以此中和负电荷，优化了 oligo/polySia 的质谱分析条件。研究成果意义重大，不仅首次成功利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）检测到 polySia 结构，还能区分 α2,8 - 和 α2,9 - 连接的 polySia。此外，研究人员将该方法拓展到分析鲑鱼卵多糖唾液酸糖蛋白（PSGP）中与 O - 连接聚糖相关的 oligo/polySia 结构，为相关领域研究开辟了新道路。该研究成果发表在《BBA Advances》上。

研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。首先是甲基化技术，对寡聚 / 多聚唾液酸进行衍生化处理；其次是 MALDI-TOF MS 及串联质谱（MS/MS）技术，用于检测和分析甲基化后的样品；还有从 PSGP 中释放 O - 连接聚糖的 β- 消除技术，结合不同条件下的亲水相互作用液相色谱（HILIC）柱纯化，以优化 oligo/polySia 的检测。

下面来看看具体的研究结果：

• 甲基化 polySia 的成功检测：研究人员对 α2,8 - 连接和 α2,9 - 连接的 polySia 进行甲基化处理，然后用 MALDI-TOF MS 在正离子线性模式下分析。结果显示，两种类型的 polySia 都呈现出典型的甲基化均聚物的 MALDI 光谱，相邻峰的质量差为 361，对应甲基化单体 Neu5Ac 的预期质量，检测到的最大聚合度为 41，这表明该方法在 MALDI-MS 分析中具有高灵敏度且未导致 polySia 降解。在正离子反射模式下分析时，添加乙酸钠作为阳离子加合物后，检测到了 oligo/polySias 的甲基化形式和氧鎓离子形式，并且 α2,8 - 和 α2,9-polySias 中氧鎓离子与甲基化形式的比例不同，α2,9-oligo/polySia 中氧鎓离子的含量明显更高。
• α2,8 - 和 α2,9-PolySia 氧鎓离子的 MS/MS 分析：对 α2,8 - 和 α2,9-oligo/polySia 的氧鎓离子进行 MS/MS 实验，发现 α2,9-(Neu5Ac)₃中 B₂和 Y₂离子的强度几乎相等，呈现出独特的碎片化模式；而 α2,8-(Neu5Ac)₃有特征性的 m/z 416 碎片离子，这一特征碎片在其他 α2,8 - 连接的 oligo/polySia 中也存在，但在 α2,9 - 连接的 oligo/polySia 中缺失，据此可区分两种连接方式的 polySia。
• 甲基化 α2,8 - 和 α2,9-polySia 的 MS/MS 分析：对甲基化的 α2,8 - 和 α2,9-(Neu5Ac)₃进行 MS/MS 分析，检测到了支持线性结构的 B₂、Y₂、B₁、Y₁等离子及相关碎片，但未发现两种连接方式的甲基化 (Neu5Ac)₃在 MS/MS 碎片化模式上有显著差异。
• PSGP 中 O - 连接聚糖的 oligo/polySia 结构检测：研究人员从湖鳟鱼卵中分离出 PSGP，优化了聚糖纯化步骤，用 β- 消除法释放 O - 连接聚糖并进行纯化。通过 MALDI-TOF MS 分析，鉴定出五种核心寡糖结构。在优化条件下，成功检测到聚合度高达 7 的 oligo/polySia 结构，且发现湖鳟鱼卵 PSGP 中的 polySia 结构为 Neu5Ac 均聚物，无 Kdn 封端，与之前对其他鳟鱼的研究结果不同，表明 PSGP 上的 polySia 种类因鱼的种类而异。

研究结论和讨论部分再次强调了该研究的重要意义。通过优化甲基化条件，研究人员成功实现了 oligo/polySia 的质谱检测，检测限低至 250 ng，灵敏度优于薄层色谱法（TLC），与高效液相色谱荧光辅助检测相当。该方法不仅能检测和区分不同连接方式的 polySia，还首次对湖鳟鱼卵 PSGP 的 O - 连接聚糖进行了质谱表征。未来，研究人员还可探索该方法能否区分其他连接方式的 polySia，这一研究为深入了解 oligo/polySia 的结构和功能，以及相关疾病的研究提供了有力的技术支持，在生命科学和健康医学领域具有广阔的应用前景。