编辑推荐：
在 mRNA 疗法发展中，mRNA 加帽效率的准确评估至关重要。研究人员利用 Pistol 核酶和液相色谱 - 质谱（LC - MS）技术开展 mRNA 加帽效率评估研究，精准量化加帽效率，为 mRNA 疗法质量控制及发展提供关键支持。
mRNA 疗法作为新兴的治疗手段，在对抗多种疾病，尤其是新冠疫情期间的疫苗研发中展现出巨大潜力。mRNA 疫苗凭借生产便捷、成本效益高、安全性好以及疗效显著等优势，迅速从实验室走向临床应用，成为预防和治疗多种疾病的热门候选技术。然而，mRNA 疗法从理论走向实际应用的过程并非一帆风顺。在众多影响因素中，mRNA 的分子完整性对其表达、免疫原性特征以及整体治疗效果有着至关重要的影响。其中，mRNA 的加帽效率更是重中之重。
mRNA 的 5′帽结构如同一个 “保护盾”，它不仅能够维持 mRNA 的结构稳定，还在 RNA 剪接、核输出、核糖体识别和翻译等多个关键环节发挥作用。特别是具有 2′ - O - 甲基化特征的 cap 1 变体，能够有效躲避细胞质先天免疫受体 RIG - I 的识别，防止免疫系统对 mRNA 的攻击，从而保证其完整性和功能。但目前在评估 mRNA 加帽效率方面却困难重重。传统的检测方法，如放射性标记和酶联免疫吸附测定（ELISA），存在特异性和灵敏度不足的问题。像之前用 RNase T2 降解 mRNA 检测 5′帽结构的方法，需要对 RNA 样本进行同位素标记，这在临床 mRNA 生产质量控制中并不适用；基于 ELISA 检测加帽的方法，又难以准确区分不同的帽状结构，容易出现假阳性结果。其他如 RNase H 消化结合亲和磁珠及 LC - MS 分析的方法，存在切割位点异质性问题，导致分析复杂化；还有定量逆转录 - 定量 PCR（qRT - qPCR）技术，虽然能对异质样本中加帽 mRNA 水平进行特异性定量，但存在序列依赖性偏差、技术要求高且操作繁琐等缺点。这些问题都严重阻碍了 mRNA 疗法的进一步发展和质量控制，因此，开发一种更精准、高效的 mRNA 加帽效率检测方法迫在眉睫。
在这样的背景下，研究人员为了解决上述难题，开展了利用 Pistol 核酶（Pistol ribozyme）和液相色谱 - 质谱（LC - MS）技术评估 mRNA 加帽效率的研究。研究成果对 mRNA 疗法的发展意义重大，有望推动 mRNA 疗法质量控制水平的提升，增强疫苗和基因治疗的有效性，从而为众多疾病的治疗带来新的突破。该研究成果发表在《Biochemical and Biophysical Research Communications》杂志上。
研究人员在这项研究中主要运用了两种关键技术方法。一是利用 Pistol 核酶进行 mRNA 的切割，Pistol 核酶具有低序列依赖性、高催化效率和简单结构的特点，能够在 Mg2 +存在的情况下，特异性地切割 mRNA 的 5′非翻译区（5′UTR），产生短的加帽或未加帽的切割产物。二是采用液相色谱 - 质谱（LC - MS）技术对切割产物进行分析，通过检测产物的分子量，以此来判断产物是否加帽，并计算出相应的加帽效率。
研究结果：
- Pistol 核酶设计：研究人员针对已获批的 BNT_162b2 mRNA 核酸序列的 5′UTR 设计了 Pistol 核酶序列。其催化核心包含 10 个高度保守的核苷酸，在高速催化中起关键作用。通过参考 Pistol 核酶env27进行序列设计，使 P2 和 P3 序列与底物 RNA 的 5′UTR 反向互补，从而实现对特定 GU 序列的切割。
- 切割产物分析：利用 Pistol 核酶在 Mg2 +诱导下切割 mRNA 的 5′UTR，产生的切割产物先通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分析，通过光密度强度值确定切割和加帽效率。之后，将切割产物通过硅胶膜柱进一步纯化，纯化后的 5′切割产物再经变性 PAGE 进行定性和定量分析，最后用 LC - MS 分析其分子量，以此来判断产物是否加帽并计算加帽效率。
研究结论和讨论：该研究成功建立了一种利用 Pistol 核酶和 LC - MS 技术评估 mRNA 加帽效率的新方法。这种方法克服了传统方法的诸多局限性，能够更准确、高效地量化 mRNA 加帽效率。准确测定 mRNA 加帽效率对 mRNA 疗法的质量控制至关重要，它直接影响着 mRNA 的稳定性、翻译效率和免疫原性。新方法的建立为 mRNA 疗法提供了更可靠的质量控制手段，有助于确保 mRNA 药物的一致性和有效性，推动 mRNA 疗法在疫苗和基因治疗领域的进一步发展，为人类健康事业带来新的希望。
