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本文研究发现 Rap1 相互作用因子 1（RIF1）可调控小鼠胚胎复制时序（RT）的巩固。RIF1 缺失会导致 RT 程序改变，影响复制叉进程等。研究还揭示其独立于核纤层相关的核组织发挥作用，为理解哺乳动物发育初期的复制和基因组组织提供关键依据。
研究背景
细胞分裂前需复制基因组以确保遗传信息的准确传递，DNA 复制的时间顺序即复制时序（RT），它具有细胞类型特异性，且与染色质状态恢复、3D 基因组组织相关。在哺乳动物胚胎发育过程中，RT 起初不明确，从 4 细胞阶段开始逐渐巩固，但相关分子调控机制未知。Rap1 相互作用因子 1（RIF1）在其他系统中对 RT 有调节作用，本研究旨在探究其在小鼠胚胎早期发育中的功能。
实验方法
- RIF1 功能缺失实验：在小鼠受精卵中注射针对 RIF1 的小干扰 RNA（siRNA），从 4 细胞阶段开始耗竭 RIF1，在 4 细胞、8 细胞和桑葚胚阶段进行单细胞复制测序（scRepli-seq），并对 RIF1 蛋白进行免疫染色验证其耗竭效果。
- 检测相关指标：通过计算曼哈顿距离、变异性分数等评估 RT 程序的协调性；分析复制起始区（IZs）、时序转换区（TTRs）和复制终止区（TZs）等特征；进行 DNA 纤维分析测定复制叉速度和起源间距离；开展 RNA 测序（RNA-seq）检测基因表达变化；利用 laminB1 - DamID 技术绘制基因组 - 核纤层相互作用图谱。
实验结果
- RIF1 耗竭影响 RT 程序协调性：RIF1 耗竭后，小鼠胚胎 RT 程序协调性降低，8 细胞和桑葚胚阶段变异性分数增加，表明 RIF1 对胚胎发育中 RT 程序的巩固至关重要，缺失 RIF1 会导致 RT 程序更不稳定、更不明确。
- RIF1 调控 RT 的巩固：在正常发育过程中，RT 特征（如 IZs、TTRs 和 TZs 的数量和大小）会随着发育而发生变化，RIF1 耗竭阻止了这种变化，使得 8 细胞和桑葚胚阶段的 RT 特征与 4 细胞阶段相似，且导致基因组向早期和晚期复制区域的分离受阻，复制叉速度减慢，起源间距离减小，体现出更早期发育阶段的特征。
- RIF1 建立发育特异性 RT 程序：主成分分析（PCA）显示，RIF1 耗竭的胚胎在 RT 特征上更接近早期发育阶段。RIF1 对不同发育阶段的 RT 调控既有共享部分，也有阶段特异性部分，且 RT 变化与转录变化无关，表明 RIF1 建立了独立于基因表达变化的、新的阶段特异性发育 RT 程序。
- RIF1 调控 RT 与核组织的关系：RIF1 耗竭导致基因组 - 核纤层相互作用发生变化，但 RT 变化与核纤层定位改变无严格相关性，表明 RIF1 独立于径向核定位调节 RT，在早期胚胎中 RT 和核纤层定位在分子层面是相互分离的。此外，研究还发现基因组区域改变 RT 时伴随着特定的染色质特征变化，如 A 和 B compartments 的差异，但 RIF1 耗竭对整体组蛋白修饰无明显影响。
讨论
本研究表明 RIF1 在小鼠胚胎 RT 调控中起关键作用，其缺失会导致 RT 程序无法正常巩固。不同细胞类型中 RIF1 缺失的表型差异可能与细胞的检查点机制有关。在小鼠胚胎中，RIF1 缺失导致的 RT 变化与转录变化无关，且胚胎中 RIF1 的表达模式可能解释 RT 的发育性巩固。此外，RIF1 耗竭对 4 细胞阶段的影响相对较小，可能与早期胚胎独特的 RT 程序和染色质配置有关。
研究局限
本研究使用的 scRepli-seq 数据分辨率较低，无法定义单个复制起点；siRNA 可能无法靶向所有 Rif1 异构体，可能低估 RIF1 的作用；免疫染色无法排除特定基因组位点的组蛋白修饰变化；由于早期胚胎材料量有限，难以通过质谱鉴定 RIF1 相互作用伙伴，且 RT 程序对发育的必要性仍不清楚。
研究意义
本研究确定了 RIF1 是小鼠胚胎发育中 RT 程序巩固的关键调节因子，揭示了其在 DNA 复制和基因组组织中的重要作用，为理解哺乳动物早期发育过程中基因组复制和组织的分子机制提供了新的视角，有助于深入探究胚胎发育的调控网络。
