基因编码标签与分子拥挤剂对异染色质蛋白HP1α相分离影响的系统性研究

这篇研究通过系统评估不同基因编码标签（如GFP/UnaG）和拥挤剂（PEG）对异染色质蛋白HP1α相分离（LLPS）的影响，揭示了标签尺寸（13-52 kDa）和连接子长度（8-16 aa）对相分离的关键调控作用。研究发现小尺寸UnaG标签（13 kDa）配合16 aa连接子可最小化干扰HP1α的相分离能力，而PEG8000虽能诱导相分离但会改变液滴生物物理特性。该研究为活细胞中HP1α动态观察提供了优化标签方案，并警示PEG在相分离研究中的潜在干扰。

　　

Motivation
细胞通过膜结合细胞器和无膜细胞器（如核仁和P小体）实现生化反应的空间区隔，其中液-液相分离（LLPS）是形成无膜细胞器的关键机制。异染色质蛋白HP1α作为基因沉默的核心效应因子，其相分离行为与异染色质空间组织密切相关。然而，现有研究多依赖基因编码荧光标签（如GFP）观察HP1α细胞动态，这些标签对HP1α固有相分离能力的影响尚未系统评估。此外，尽管聚乙二醇（PEG）常被用作分子拥挤模拟剂，其对相分离液滴特性的影响仍不明确。

Highlights
研究团队通过体外实验体系揭示：

1. GFP标签（27 kDa）会显著抑制HP1α相分离，而小尺寸UnaG标签（13 kDa）配合16氨基酸甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸（GGS）连接子可保留HP1α相分离能力
2. 拥挤剂PEG8000能诱导本无相分离倾向的HP1α突变体（CSDm）形成液滴，并减弱DNA对相分离的促进作用
3. PEG显著改变相分离液滴的生物物理特性，其诱导的相分离可能偏离生理状态

Effects of tag size and linker length
HP1α通过N端延伸区（NTE）与铰链区相互作用驱动相分离，而C端延伸区（CTE）具有自抑制功能。研究团队设计四组C端标签构建体（HP1α-8/16aa-mEGFP、HP1α-8/16aa-UnaG），发现：

• 化学标记的HP1α-KCK-Atto488与野生型（WT）相分离饱和浓度均为3.3 μM
• HP1α-16aa-mEGFP在450 μM仍不形成液滴，缩短连接子至8 aa后需250 μM才能形成非球形凝聚体
• 未结合胆红素（apo）的UnaG标签几乎不干扰相分离，而结合态（holo）UnaG需16 aa连接子才能维持功能

AID标签的意外效应
含50 kDa辅助诱导降解标签（AID-sfGFP）的HP1α相分离能力反而增强，饱和浓度降至1.3 μM。序列分析显示AID含内在无序区（IDR），其促进相分离的特性可能补偿了sfGFP的抑制作用。

Cellular validation
通过CRISPR-Cas9在内源性HP1α上引入16aa-UnaG/eUnaG标签，发现：

• 标记蛋白在U2OS细胞中形成与DNA共定位的异染色质斑点
• 荧光恢复后漂白（FRAP）显示恢复动力学（56.9%-67.5%）与既往GFP标记研究相当

PEG的调控机制
10% PEG8000可使HP1α CSDm突变体（原需>147 μM）在22.5 μM即发生相分离：

• 降低相分离对DNA的依赖性，WT HP1α在有无DNA时饱和浓度均为3.3 μM
• 显著减缓液滴内分子运动，完全漂白液滴仅恢复12.45%（对照组93%）
• 诱导球形蛋白MBP（无IDR）在10 μM相分离，提示其作用非特异性

Discussion
该研究确立HP1α-16aa-(holo)UnaG为最小干扰的标记方案，其相分离饱和浓度（6.9 μM）与WT接近，FRAP快慢相恢复时间分别为3.1 s和21.1 s。值得注意的是：

1. 细胞拥挤环境可能通过内源性HP1α招募或异染色质组分互作补偿大标签的抑制作用
2. PEG通过改变分子相互作用网络（非单纯增加浓度）诱导相分离，需谨慎解读相关实验结果
3. AID标签中IDR的发现为设计功能增强型标签提供新思路

Limitations
研究未评估标记HP1α对基因表达等表型的影响，未来需结合功能实验验证相分离与基因沉默的关联性。