微流控流式细胞技术揭示人中性粒细胞中羟基羧酸3受体(HCA3R)的激活与信号转导机制

本研究通过创新的微流控流式细胞技术(LPI)结合亚细胞颗粒分选和LC-MS/MS，首次在人类中性粒细胞中鉴定出羟基羧酸3受体(HCA3R/GPR109B)的蛋白表达，并揭示其内源性激动剂3-OH-C8和合成激动剂IBC 293通过Gαi偶联途径激活钙信号，而NADPH氧化酶的激活则需依赖细胞骨架破坏或FFA2R变构调节的跨受体激活机制。该发现填补了中性粒细胞GPCR信号网络的空白，为代谢-免疫调控提供了新靶点。

　　

研究背景
中性粒细胞作为先天免疫的核心效应细胞，其功能调控高度依赖G蛋白偶联受体(GPCR)信号网络。然而现有技术难以全面鉴定中性粒细胞膜蛋白组，导致包括羟基羧酸3受体(HCA₃R)在内的多个功能明确的GPCR长期未被蛋白水平证实。更关键的是，β-氧化中间产物3-羟基辛酸(3-OH-C8)作为HCA₃R内源性配体在脂肪细胞中发挥抗脂解作用，但其在中性粒细胞中的功能机制仍是空白。

技术方法
瑞典哥德堡大学团队采用两步Percoll梯度分离中性粒细胞亚细胞组分，通过微流控流式细胞室固定膜结构，胰酶消化暴露肽段后进行LC-MS/MS分析。功能实验采用Fura-2钙离子检测和isoluminol化学发光法分别测定[Ca²⁺]_i和NADPH氧化酶活性，结合细胞骨架破坏剂latrunculin A和FFA2R变构调节剂Cmp58处理。

研究结果
3.1 HCA₃R的鉴定
通过LPI技术从γ(质膜/分泌小泡)和β(特异性/明胶酶颗粒)组分中鉴定出HCA₃R胞内尾端特征肽段STSVELTGDPNK，同时首次在蛋白水平证实FFA2R表达。

3.2 钙信号激活
3-OH-C8(600 μM)和IBC 293(5 μM)均诱导[Ca²⁺]_i升高，且存在受体同源脱敏。Gα_q抑制剂YM-254890不影响该反应，提示HCA₃R通过Gα_i偶联激活PLC。

3.3 NADPH氧化酶调控
在latrunculin A处理的细胞中，IBC 293(EC₅₀=9 μM)和3-OH-C8可激活NADPH氧化酶，但细胞骨架完整时无此效应。与P2Y₂R类似，脱敏后的HCA₃R不能被latrunculin A再激活。

3.4 受体跨激活机制
TNF预刺激后，FFA2R变构调节剂Cmp58使IBC 293(EC₅₀=3 μM)的氧化酶激活效应增强10倍，该过程被FFA2R拮抗剂CATPB完全抑制，但信号转导具有偏向性——不影响钙信号。

3.5 信号偏向性
Cmp58对IBC 293的增效作用不具互惠性，表明HCA₃R与FFA2R的跨激活是单向过程。

结论与意义
该研究在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》发表的重要发现包括：①建立LPI技术突破GPCR检测瓶颈；②揭示HCA₃R通过Gα_i-PLCβ-Ca²⁺通路调控中性粒细胞；③发现代谢物3-OH-C8通过细胞骨架依赖的NADPH氧化酶激活新机制；④阐明FFA2R变构调节产生的"信号放大器"效应。这些发现为理解代谢-免疫对话提供了分子基础，特别为肥胖相关炎症中脂肪酸代谢物调控中性粒细胞功能提供了新视角。