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在发展中国家，腹泻是导致老人和儿童发病及死亡的重要原因，肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）是致病因素之一。为降低 IpaD 蛋白疫苗成本，研究人员融合 IpaD 与 EGFP 基因，提升了融合蛋白表达、溶解和稳定性，且具免疫原性，有望打破冷链局限。
在全球范围内，腹泻问题严重威胁着人类健康，尤其在发展中国家，它是导致老年人和儿童发病与死亡的重要因素之一。肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）作为引发细菌性痢疾或水样腹泻的病原体，由于其与志贺氏菌在生理和生化特性上极为相似，给诊断和评估带来了极大挑战。而且，针对 EIEC 菌株的抗菌治疗效果有限，抗生素的过度使用还增加了耐药风险。在这样的困境下，疫苗接种成为对抗 EIEC 和志贺氏菌引发疾病的关键手段。
此前研究发现，侵袭质粒抗原 D（IpaD）是一种具有潜在疫苗开发价值的保守蛋白。然而，IpaD 蛋白在室温下不稳定，这一特性严重限制了其作为治疗药物或疫苗的应用。因为蛋白质治疗药物面临着重组蛋白不稳定的难题，并且需要持续冷藏的 “冷链” 来保存，不仅成本高昂，还不能完全保证蛋白质的效力。对于资源匮乏国家的儿童这一腹泻疫苗的主要目标人群来说，价格低廉的疫苗才更具可及性。
为了解决这些问题，来自印度国家理工学院（National Institute of Technology, Durgapur）的研究人员开展了一项极具创新性的研究。他们利用融合技术，将 IpaD 基因与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因通过柔性接头（GGGGS）3进行融合，构建了新型重组融合蛋白 IpaD - EGFP。研究结果令人振奋，这种融合策略显著提升了蛋白的表达水平（提高约 53%）、溶解度（提高约 77%）和稳定性。在不同储存温度下，该融合蛋白的二级结构能保持稳定，甚至在 25°C 下也可稳定保存长达 1 个月，这对于打破昂贵的 “冷链” 限制意义重大。此外，IpaD - EGFP 融合蛋白能在 Raw 267.4 细胞中激活半胱天冬酶 3/7（caspases 3/7），从而引发细胞凋亡，并且在 BALB/c 小鼠体内诱导产生抗体反应，证明了其具有免疫原性。这些研究成果发表在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics》上，为基于 IpaD 的蛋白质治疗药物的设计与生产开辟了新途径，有望降低疫苗成本，提高其可及性，对全球腹泻疾病的防控具有重要意义。
研究人员开展研究时运用了多种关键技术方法。在构建融合蛋白方面，通过基因工程技术将 EGFP 基因插入到先前研究的 pHis - TEV - IpaD 载体的 C 末端，实现 IpaD 与 EGFP 的融合。在蛋白检测与分析上，采用 Western blot 和 ELISA 技术来评估血清中抗原特异性抗体反应，以此判断融合蛋白的免疫原性。同时，利用结构稳定性分析技术研究融合蛋白在不同储存温度下的结构变化情况。
下面来详细了解研究结果：
- IpaD - EGFP 重组质粒载体的构建：研究人员将 EGFP 基因的 N 末端插入到 pHis - TEV - IpaD 载体的 C 末端，成功构建了 pHis - TEV - IpaD（GGGGS）3 - EGFP 载体。这一构建为后续融合蛋白的可追踪表达和纯化奠定了基础。
- 融合蛋白的表达、溶解度和稳定性提升：通过实验对比发现，IpaD - EGFP 融合蛋白的总体表达水平从天然 IpaD 的约 37% 提升至 53%，溶解度也从天然 IpaD 的约 61% 提高到 77%。结构稳定性分析表明，该融合蛋白在 4°C、?20°C、?80°C 和 25°C 等不同储存温度下，都能保留其二级结构，在 25°C 下甚至可稳定保存 1 个月，这一成果对突破 “冷链” 限制至关重要。
- 融合蛋白的细胞毒性和免疫原性研究：细胞实验显示，IpaD - EGFP 融合蛋白能在 Raw 267.4 细胞中激活 caspases 3/7，引发细胞凋亡，产生与 IpaD 蛋白相似程度的细胞毒性反应，证明其在细胞水平上具有生物活性。在动物实验中，对 BALB/c 小鼠进行免疫后，通过 Western blot 和 ELISA 检测发现小鼠血清中产生了抗原特异性抗体反应，证实了 IpaD - EGFP 融合蛋白具有免疫原性。
研究结论和讨论部分表明，这项研究首次成功设计出 EIEC IpaD 蛋白的融合构建体，利用荧光融合技术有效提升了 IpaD 蛋白的稳定性、实现了可追踪表达和简便纯化。融合蛋白在提升表达、溶解和稳定性方面效果显著，同时还具备细胞毒性和免疫原性。这一成果为基于 IpaD 的蛋白质治疗药物的开发提供了新方向，有望打破 “冷链” 限制，降低疫苗生产成本，使更多人受益，尤其对资源匮乏地区腹泻疾病的防控具有重要的应用前景和社会价值。
