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重组酶聚合酶扩增（RPA）中，T4 基因 32（gp32）蛋白存在稳定性和功能局限。研究人员通过构建二硫键和虚拟饱和诱变筛选 gp32 突变体。V62C/T80C 和 Y186R 等突变体显著提升 RPA 性能，对推动 RPA 临床应用意义重大。
在生命科学和医学领域，核酸检测至关重要。以往，聚合酶链反应（PCR）作为广泛应用的核酸扩增技术，却存在依赖昂贵设备进行复杂温度循环的弊端，在资源有限或偏远地区难以施展拳脚。为解决这一难题，等温核酸扩增技术应运而生，其中重组酶聚合酶扩增（RPA）凭借能在 37 - 42°C 恒温条件下，20 - 30 分钟内实现核酸扩增，且灵敏度和特异性与 PCR 相当的优势，成为即时检测（POC）的热门选择。
然而，RPA 的 “得力助手”—— 单链 DNA 结合蛋白 T4 基因 32（gp32），却有着自身的 “小毛病”。它在维持 RPA 中突触前细丝形成和 D 环稳定方面虽作用关键，但结构稳定性欠佳、易与引物发生非特异性相互作用，这严重制约了 RPA 的进一步发展。为突破这些瓶颈，来自国内的研究人员开启了一场探索之旅，旨在优化 gp32，提升 RPA 性能，相关研究成果发表在《Biochimie》上。
研究人员主要采用了两种关键技术方法。一是理性设计二硫键，通过精准改变蛋白结构来增强稳定性；二是虚拟饱和诱变，针对关键的单链 DNA 结合位点进行突变筛选，找出性能更优的变体。
研究结果方面：
- 突变体筛选：经一系列实验，研究人员成功筛选出 V62C/T80C、S78C/S86C、N100R、G140P 和 Y186R 这五个表现卓越的 gp32 突变体，它们在 RPA 性能上远超野生型蛋白。
- V62C/T80C 的优势：V62C/T80C 突变体堪称 “加速小能手”，它显著加快了 RPA 的扩增进程，将反应时间缩短了 47%。这得益于其通过增强 UvsX - 单链 DNA（ssDNA）突触前细丝的形成，为后续的扩增反应奠定了良好基础。
- Y186R 的优势：Y186R 突变体也毫不逊色，在整个扩增周期内，它使 RPA 的效率提升了 123%。这主要是因为它优化了与 ssDNA 的结合能力，从而稳定了 D 环结构，保障了扩增过程顺利进行。
- 分子机制探究：借助分子动力学（MD）模拟技术，研究人员深入探索了突变体提升 RPA 效率的内在机制。发现 V62C/T80C 突变体中，二硫键增强了蛋白整体刚性；而 Y186R 突变体则优化了关键 DNA 结合残基的灵活性，这些变化共同促进了 RPA 效率的提高。
研究结论表明，通过理性设计二硫键和虚拟饱和诱变策略对 gp32 进行改造，能有效提升 RPA 的性能。V62C/T80C 和 Y186R 等突变体的出现，为缩短 RPA 反应时间、增强反应效率提供了可行方案。这一研究成果意义非凡，不仅为优化蛋白质工程策略提供了宝贵思路，还为等温扩增技术迈向更广泛的临床和即时诊断应用领域注入了强大动力，有望让更多患者在第一时间获得准确的检测结果，助力医疗事业的蓬勃发展。
