探秘 Toll 样受体（TLR2/6）激动剂脂质化氨基酸或肽缀合物的自组装：独特形貌与生物活性的奥秘

为探究 Pam2Cys 和 Pam3Cys 基化合物的自组装及生物活性，研究人员对比多种缀合物。结果显示它们均有临界聚集浓度，且自组装结构不同，部分缀合物具良好细胞相容性和 TLR2/6 激动剂活性。该研究为免疫疗法提供新思路。

　　在生命科学和健康医学领域，Toll 样受体（TLR）激动剂一直是研究的热点。它们在免疫疗法和癌症疫苗等方面有着巨大的潜力，就像一把把神奇的钥匙，有望开启人体免疫系统对抗疾病的大门。其中，基于 Pam₂Cys 或 Pam₃Cys 的 TLR2 激动剂最为常见。然而，此前对于这类分子的自组装研究相对较少，就像一座尚未完全被探索的神秘岛屿，隐藏着许多未知的奥秘。比如，这些分子在水溶液中究竟如何自组装形成不同的结构？它们又具有怎样的生物活性？这些问题一直困扰着科研人员。

为了揭开这些谜团，来自未知研究机构的研究人员开展了一项深入的研究。他们将目光聚焦于 Pam₂Cys 和 Pam₃Cys 基化合物，详细对比了亲本 Pam₂CysOH 和 Pam₃CysOH 与生物活性 TLR 激动剂脂肽 Pam₂CysSK₄和 Pam₃CysSK₄的自组装情况。研究发现，所有被检测的缀合物都存在一个临界聚集浓度，这一发现就像找到了打开自组装大门的关键线索。通过小角 X 射线散射（SAXS）、低温透射电子显微镜（cryo-TEM）和共聚焦荧光显微镜等技术，研究人员惊奇地发现，Pam₂CysOH 和 Pam₃CysOH 会形成单层囊泡，而 Pam₂CysSK₄形成球形胶束，Pam₃CysSK₄则主要形成蠕虫状胶束。这表明不同结构的缀合物在自组装过程中有着独特的 “行为模式”。

此外，研究人员还对缀合物的细胞相容性和 TLR2/6 激动剂活性进行了评估。结果显示，Pam₂CysOH、Pam₂CysSK₄和 Pam₃CysSK₄在足够低的浓度下都表现出良好的细胞相容性，其中 Pam₂CysOH 在高浓度下的细胞相容性甚至优于其对应的 Pam_nCysSK₄类似物。而在 TLR2/6 激动剂活性方面，Pam₂CysOH 也展现出了一定的活性，能够刺激分泌碱性磷酸酶（SEAP）的产生。

这项研究成果发表在《Bioconjugate Chemistry》上，具有重要的意义。它不仅揭示了 Pam₂Cys 和 Pam₃Cys 基化合物的自组装规律和生物活性，为理解这类分子的行为提供了关键信息，还为未来免疫疗法的发展提供了新的思路和潜在的应用方向。比如，基于这些发现，科研人员可以进一步设计和优化相关分子，开发出更有效的免疫治疗药物。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是通过脂质染料探针荧光测定法确定临界聚集浓度（CAC），以此判断缀合物的聚集情况；二是利用 SAXS、cryo-TEM 和共聚焦显微镜来探究自组装结构，从不同角度观察纳米结构的形貌；三是运用圆二色谱（CD）光谱探测肽的构象，了解分子的结构特征；四是借助动态光散射（DLS）获取囊泡的平均尺寸，对纳米结构的大小进行量化；五是采用 MTT 法评估细胞相容性，检测细胞的健康状况；六是通过分泌胚胎碱性磷酸酶（SEAP）测定法衡量 TLR2/6 激动剂活性，判断分子对免疫反应的刺激程度 。

下面详细介绍一下研究结果：

• 临界聚集浓度（CAC）：研究人员使用尼罗红进行荧光测定，发现所有缀合物（Pam₂CysOH、Pam₃CysOH、Pam₂CysSK₄和 Pam₃CysSK₄）的 CAC 值都在 0.028 - 0.061 wt% 之间，且与 Pam 链的数量和氨基酸 / 肽序列并无明显关联。同时，所有样品与尼罗红对照相比都出现了一定程度的蓝移，其中 Pam₂CysOH 的蓝移较为显著，而 Pam₃CysOH 的蓝移相对较小。这表明聚集物具有极性核心，影响了尼罗红的量子产率，也证明了这些缀合物在特定浓度下会发生聚集现象。
• 自组装结构：通过 SAXS、cryo-TEM 和共聚焦显微镜的联合使用，研究人员发现 Pam₂CysSK₄形成核 - 壳球形胶束，Pam₂CysOH 形成单层囊泡，其强度曲线与 Pam₂CysSK₄有明显差异。Pam₃CysSK₄则自组装成蠕虫状胶束（与球状胶束共存），Pam₃CysOH 形成的是单层囊泡，且其囊泡尺寸比 Pam₂CysOH 的更大。此外，Fmoc - Pam₂CysOH 形成的是囊泡状结构，部分囊泡具有外部结构，SAXS 数据显示其具有多层结构，与 Pam₂CysOH 和 Pam₃CysOH 的单层囊泡结构不同。这些结果表明，不同缀合物的结构差异会导致其自组装形成截然不同的纳米结构。
• 二级结构：利用 CD 光谱对 Pam₂CysSK₄和 Pam₃CysSK₄的二级结构进行探测，结果与之前的报道一致，Pam₂CysSK₄呈现无规卷曲结构，Pam₃CysSK₄则具有 β - 折叠结构。这些构象与它们所形成的胶束和蠕虫状胶束结构相互关联，进一步说明了分子结构与自组装结构之间的紧密联系。
• 细胞相容性：通过 MTT 法对 Pam₂CysOH、Pam₂CysSK₄和 Pam₃CysSK₄的细胞相容性进行检测，发现 Pam₂CysOH 在低浓度下具有良好的细胞相容性，但当浓度高于 0.025 wt% 时，细胞活力会显著下降。Pam₂CysSK₄在浓度高于 0.0125 wt% 时表现出细胞毒性，Pam₃CysSK₄仅在浓度低于 0.0062 wt% 时才被细胞所耐受。由此可见，Pam₂CysOH 在高浓度下的细胞相容性相对较好，优于其对应的 Pam_nCysSK₄类似物。
• TLR2/6 激动剂活性：使用 HEK - blue TLR2/6 细胞进行 SEAP 测定，对比 Pam₂CysOH 与 Pam₂CysSK₄和 Pam₃CysSK₄的激动剂活性。结果显示，Pam₂CysSK₄和 Pam₃CysSK₄能够刺激 HEK - Blue 细胞中 SEAP 的表达增加 10 倍或更多，Pam₂CysOH 也表现出一定的激动剂活性，在 0.0125 wt% 的浓度下，能使 SEAP 的产生增加约 8 倍，不过其诱导的 SEAP 量存在较大差异。这表明 Pam₂CysOH 具有刺激免疫反应的潜力，为免疫疗法的研究提供了新的方向。

综合上述研究结果，研究人员得出结论：不同的 Pam₂Cys 和 Pam₃Cys 基化合物在自组装行为上存在显著差异，形成了不同的纳米结构。这些纳米结构的差异可能与分子的电荷、脂质链数量以及 β - 折叠结构等因素有关。同时，部分缀合物在低浓度下具有良好的细胞相容性和 TLR2/6 激动剂活性，尤其是 Pam₂CysOH，因其囊泡结构和潜在的免疫刺激活性，在免疫疗法的研究中具有重要的潜在价值。然而，目前的研究仍存在一些局限性，比如对于这些缀合物在体内的作用机制和效果还需要进一步深入研究。未来的研究可以朝着优化分子结构、提高生物活性以及探索体内应用等方向展开，这将有助于推动免疫疗法的发展，为攻克更多的疾病带来新的希望。