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为解决大麻素植物提取面临的挑战与稀缺问题，研究人员以解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为平台开展大麻素生物合成研究。成功实现多种大麻素及其类似物的从头生物合成，证明该酵母潜力巨大，为相关研究和药用开辟新途径。
大麻，这一古老的植物，在人类历史上占据着独特的地位。它不仅与社会、宗教活动紧密相连，更在医学领域有着超过 2700 年的应用历史。大麻发挥治疗作用的关键在于大麻素，它能与人体的内源性大麻素系统（ECS）相互作用，对焦虑、疼痛、炎症等多种生理过程产生影响。其中，大麻二酚（CBD）作为主要的非精神活性成分，已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗特定癫痫疾病。另一种关键大麻素 —— 大麻萜酚酸（CBGA），不仅是其他大麻素的前体，还在抗癫痫、治疗代谢紊乱和对抗新冠病毒等方面展现出潜力。
然而，从植物中提取大麻素面临诸多难题。一方面，植物提取受土地资源限制，需要大量耕地来种植大麻；另一方面，气候变化会影响大麻的生长和产量，导致大麻素供应不稳定。此外，植物提取过程复杂，成本较高。因此，寻找一种更高效、可持续的大麻素生产方法迫在眉睫。
在此背景下，来自未知研究机构的研究人员将目光投向了解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica），开展了大麻素及其类似物在该酵母中的从头生物合成研究。研究成果发表在《BioDesign Research》上，为大麻素的生产开辟了新的道路。
研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。首先是基因工程技术，通过对相关基因进行密码子优化，增强其在解脂耶氏酵母中的表达；利用 Cre-loxP 重组系统进行基因敲除和整合，精准调控酵母的基因表达。其次，采用高效液相色谱（HPLC）和液相色谱 - 质谱联用（LC-MS）技术对大麻素产品进行定量分析，确保实验结果的准确性。此外，借助共聚焦激光扫描显微镜观察蛋白的亚细胞定位，深入了解相关酶在酵母细胞内的分布情况。
优化前体供应提高橄榄酸（OLA）产量
大麻二酚（CBD-C5）的生物合成途径包含多个模块，其中橄榄酸（OLA）的合成是关键步骤。OLA 由己酰辅酶 A 和丙二酰辅酶 A 在橄榄醇合酶（OLS）和橄榄酸环化酶（OAC）的作用下生成，而己酰辅酶 A 的供应是 CBD 合成的限速步骤。研究人员通过表达来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440 的短链酰基辅酶 A 合成酶基因 PpLvaE，有效提高了己酰辅酶 A 的合成效率。同时，通过将 OLA 表达盒整合到不同染色体位点、敲除 DGA1 基因并过表达 ylACC1 基因，成功提高了丙二酰辅酶 A 的可用性。经过一系列优化，最终使 OLA 产量达到 6.73mg/L。
优化 GPP 供应和 prenyltransferase 模块提高 CBGA 产量
香叶基焦磷酸（GPP）的供应是萜烯生物合成的另一个限速因素。研究人员利用来自酿酒酵母（S. cerevisiae）的突变体 ScERG20*F96W/N127W和来自解脂耶氏酵母的突变体 ylERG20*F88W/N119W，促进 GPP 的优先合成。同时，引入来自粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的异源基因mvaE和mvaS，增强 IPP 和 DMAPP 前体的供应，从而增加了 GPP 的通量。此外，对 prenyltransferase（PTase）进行优化，通过共表达不同的 PTase、融合 ER 信号标签等策略，最终使 CBGA 产量达到 15.7mg/L（添加 OLA 时）。
凝聚相囊泡样双 PTase 表达提高 CBGA 产量
在前期研究的基础上，研究人员发现单独增加 tCsPT4 的拷贝数，CBGA 产量仍低于 1mg/L。为解决这一问题，他们共表达了具有互补活性的 NphB，结果发现双 PTase 共表达形成的凝聚相囊泡样结构显著提高了 CBGA 产量。进一步优化 GPP 通量后，菌株 YX112 的 CBGA 产量达到 2.85mg/L，添加 OLA 和 ERG7 抑制剂后，产量更是高达 15.77mg/L。
大麻二酚（CBD-C1）前体苔色酸（OSA）的生物合成
大麻二酚（CBD-C1）是一种研究较少但具有潜在治疗应用的大麻素，其前体苔色酸（OSA）具有抗氧化和神经保护特性。研究人员从蜜环菌（Armillaria mellea）中鉴定出迭代型 I 聚酮合酶 —— 苔色酸合酶（ArmB），并将其整合到解脂耶氏酵母中，成功实现了 OSA 的异源表达。通过增强丙二酰辅酶 A 的供应和优化发酵条件，最终使 OSA 产量达到 18.87mg/L。
大麻二酚（CBD-C1）类似物大麻萜酚酸（CBGOA）的生产
大麻二酚（CBD-C1）类似物大麻萜酚酸（CBGOA）的生产策略与 CBGA 类似。研究人员通过整合相关基因提高 GPP 通量，并采用单 PTase 和双 PTase 表达系统。结果表明，具有凝聚相囊泡样双 PTase 表达系统的菌株 YX206，其 CBGOA 产量最高，达到 409μg/L。
工程菌株 YX112 和 YX206 的补料分批培养
为进一步优化工程菌株 YX112 和 YX206 的生产性能，研究人员进行了补料分批培养实验。在培养 YX112 时，添加 1mM 己酸后，菌株生长稳定，OLA 和 CBGA 产量逐步积累，最终 CBGA 产量达到 3.537mg/L。培养 YX206 时，以葡萄糖为底物，OSA 产量持续增加，最终达到 18.87mg/L，但 CBGOA 产量相对较低，为 541μg/L。
研究人员成功在解脂耶氏酵母中实现了大麻素及其类似物的从头生物合成，这一成果意义重大。首先，证明了解脂耶氏酵母作为底盘细胞生产复杂萜烯和聚酮化合物的潜力，为大麻素的可持续生产提供了新的平台。其次，研究中采用的代谢工程策略，如优化前体供应、工程化 PTase 等，为其他复杂天然产物的生物合成提供了借鉴。然而，目前仍存在一些限制大麻素产量的因素，如前体供应不足、PTase 的催化效率和定位不理想、酸毒性等。未来，通过设计新的前体途径、酶工程和适应性实验室进化等方法，有望进一步提高大麻素的产量，推动大麻素从实验室研究走向工业化生产，为医药领域提供更多有效的治疗药物。
