PMA-qPCR技术评估消毒剂处理后多菌种口腔生物膜中活菌定量的应用研究

本研究针对传统qPCR无法区分死/活菌导致活菌数高估的问题，通过PMA-qPCR技术定量分析氯己定(CHX)和次氯酸钠(NaOCl)处理后的五菌种口腔生物膜活菌数。结果显示PMA-qPCR与培养法(CFU)在活菌占优时相关性良好，但高死菌背景下存在假阳性信号，提示需优化PCR靶标选择。该研究为口腔抗菌剂效力评估提供了分子生物学方法学参考。

　　

在口腔微生物研究中，准确区分生物膜中的活菌与死菌对评估抗菌措施效果至关重要。传统定量PCR(qPCR)会同时扩增死/活菌DNA，导致活菌数高估；而培养法(CFU)对厌氧菌检测灵敏度不足且耗时长。针对这一技术瓶颈，瑞士苏黎世大学的研究团队创新性地将丙啶单氮化物(PMA)预处理与qPCR联用，建立PMA-qPCR方法，用于评估两种常用口腔消毒剂对五菌种生物膜的杀菌效果，相关成果发表于《Biofilm》。

研究采用羟基磷灰石片培养64小时的模式生物膜，包含需氧菌(变形链球菌S. mutans、口腔链球菌S. oralis)和严格厌氧菌(具核梭杆菌F. nucleatum、变形放线菌A. oris、殊异韦荣球菌V. dispar)。关键技术包括：(1)设计靶向单拷贝基因(rgg/rpoB)和多拷贝16S rDNA的TaqMan探针qPCR；(2)建立通用dnaK基因SYBR Green qPCR；(3)优化50μM PMA处理条件；(4)对比单次/六次消毒处理(0.2% CHX或3% NaOCl作用2分钟)后的CFU与qPCR计数差异。

【qPCR assay performance】
通过5种TaqMan assays和dnaK SYBR Green assay的校准曲线验证，所有qPCR均呈现6 log₁₀线性范围。其中靶向单拷贝基因的S. oralis(rgg)和V. dispar(rpoB)检测限(LoD)达5-4 GE/反应，而多拷贝16S rDNA检测的A. oris LoD较高(29 GE)。新开发的dnaK通用引物可同步检测五菌种，但需添加A. oris特异性引物补偿其67%高GC含量导致的扩增偏差。

【PMA-qPCR区分死/活菌】
纯菌实验显示：70%异丙醇(IPA)和0.2% CHX处理后，PMA使死菌ΔCq增加2-15.6（SYBR Green assay差异更显著），而活菌ΔCq仅-0.5-1.2。值得注意的是，3% NaOCl会直接破坏DNA，导致无论是否PMA处理均显著抑制PCR扩增，提示氧化剂对核酸的损伤不可忽视。

【消毒生物膜的活菌定量】
在单次CHX处理的成熟生物膜中，PMA-qPCR与CFU计数高度一致（总菌差0.6 log₁₀），且PMA使qPCR信号降低1-1.6 log₁₀，证实约90% DNA来自死菌。但对严格厌氧菌F. nucleatum，CFU始终显著低于PMA-qPCR（差1.5 log₁₀），反映培养法对厌氧菌的局限性。六次消毒处理后，尽管CFU检测为阴性，PMA-qPCR仍检出信号（总菌差4.6 log₁₀），表明现有方法无法完全消除死菌DNA干扰。

讨论部分指出，PMA-qPCR在活菌主导样本中可靠性高，但在高死菌背景下存在方法学局限：①多拷贝16S rDNA靶标易残留未修饰DNA；②短片段(<200bp)扩增降低PMA抑制效率；③NaOCl的DNA氧化作用干扰结果解读。研究者建议未来采用更长扩增子(200-400bp)和单拷贝靶基因优化检测。该研究不仅为口腔抗菌剂评估提供新范式，其建立的dnaK通用qPCR更为复杂微生物群落的活菌定量开辟了新思路。