蔗糖通过 PTS 组件 ScrA 和 Crr 抑制肺炎克雷伯菌生物膜形成的机制探秘

为探究蔗糖对肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）生物膜形成的影响及相关机制，研究人员开展了相关研究。结果发现 1% 蔗糖可减少生物膜形成，且与 PTS 组件 ScrA 和 Crr 有关。该研究拓展了对蔗糖影响生物膜形成的认知。

　　在生活中，糖无处不在，它不仅给我们带来甜蜜的味觉享受，还与微生物有着千丝万缕的联系。就拿蔗糖来说，以往研究发现，它对不同细菌生物膜的形成有着不同影响。在一些细菌中，蔗糖能促进生物膜形成，比如变形链球菌（Streptococcus mutans）在 1% 蔗糖环境下，生物膜形成量近乎增长四倍；大肠杆菌（Escherichia coli） O157:H7 在 20mM（0.68%）蔗糖作用下，因细菌脂多糖（LPS）产量提升，生物膜也有所增加 。然而，在另一些细菌里，蔗糖却毫无影响，像 61 株金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）临床分离株的生物膜形成就不受蔗糖影响；铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在 1% - 5% 蔗糖浓度下，生物膜形成也没有变化 。可对于肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），蔗糖对其生物膜形成的影响一直是个未解之谜。

肺炎克雷伯菌是肠杆菌科的一员，在自然环境中广泛存在，比如常见于地表水和土壤里。它还是一种机会致病菌，能引发肺炎、尿路感染、菌血症以及化脓性肝脓肿等多种疾病。不仅如此，它还是人和动物肠道微生物群的一部分，并且具有在非生物表面和人体组织上形成生物膜的能力。一旦在医疗器械上形成生物膜，就会大大增加感染风险，像导管相关尿路感染、导管相关血流感染和呼吸机相关性肺炎等都与之相关。所以，搞清楚蔗糖对肺炎克雷伯菌生物膜形成的影响及机制，对防控相关感染意义重大。

来自中国的研究人员为了揭开这个谜团，开展了一系列研究。他们发现，1% 的蔗糖能减少肺炎克雷伯菌 STU1 的生物膜形成，并且这一过程与磷酸烯醇式丙酮酸 - 碳水化合物磷酸转移酶系统（PTS）中的 ScrA 和 Crr 有关。这一研究成果发表在《Biofilm》上，为该领域的研究提供了新的思路和方向。

研究人员在研究过程中，运用了多种关键技术方法。他们通过构建基因敲除突变体（如 ΔscrA、Δcrr、ΔcrrΔscrA），探究相关基因在生物膜形成中的作用；利用生物膜定量实验，准确测定不同条件下生物膜的形成量；采用蔗糖发酵实验，判断细菌对蔗糖的利用情况；运用 Western blotting 和逆转录定量实时聚合酶链反应（RT - qPCR）技术，分别从蛋白质和基因转录水平分析相关蛋白和基因的表达变化；此外，还借助秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）模型，研究蔗糖对肺炎克雷伯菌在宿主体内数量的影响 。

研究结果

1. 蔗糖减少肺炎克雷伯菌生物膜形成：研究人员对比了肺炎克雷伯菌 STU1 在含 1% 蔗糖和不含蔗糖的 LB 培养基中生物膜的形成情况，发现蔗糖显著降低了野生型（WT）菌株的生物膜形成量。同时，研究还检测了蔗糖对细菌生长的影响，结果表明蔗糖虽对细菌生长略有促进，但并非生物膜减少的原因。此外，研究人员探究了 pH 对生物膜的影响，发现不同 pH 条件下，蔗糖均能减少生物膜形成，由此推测蔗糖减少生物膜形成与蔗糖摄取有关，而非其发酵产生的酸性产物。
2. scrA 突变体的生物膜不受蔗糖影响：研究人员敲除了K. pneumoniae STU1 中的scrA基因，构建了 ΔscrA突变体。实验发现，ΔscrA突变体在以蔗糖为唯一碳源的 M9 培养基中生长存在缺陷，且不能发酵蔗糖。进一步研究发现，与 WT 不同，ΔscrA突变体在含蔗糖和不含蔗糖的 LB 培养基中生物膜形成量无显著差异，而补充scrA基因后可恢复表型，这表明蔗糖通过 ScrA 减少肺炎克雷伯菌生物膜形成。
3. 蔗糖依赖 ScrA 减少线虫肠道内肺炎克雷伯菌数量：研究人员将携带绿色荧光基因的质粒导入 WT 和 ΔscrA菌株，喂食秀丽隐杆线虫。结果显示，在含蔗糖的线虫生长培养基（NGM）上，喂食 WT 菌株的线虫荧光强度降低，表明蔗糖减少了线虫肠道内肺炎克雷伯菌数量；而喂食 ΔscrA菌株的线虫，其荧光强度不受蔗糖影响。通过菌落形成单位测定实验也证实了这一结果，说明 ScrA 参与了蔗糖减少线虫肠道内肺炎克雷伯菌数量的过程。
4. 蔗糖通过 ScrA 减少菌毛表达：Ⅲ 型菌毛对细菌附着表面至关重要。研究人员通过 Western blotting 和 RT - qPCR 检测发现，在含蔗糖的 LB 培养基中，WT 菌株的 MrkA 蛋白和mrkA转录本含量均低于不含蔗糖的 LB 培养基，而 ΔscrA菌株在两种培养基中的含量无显著差异，表明 ScrA 参与了蔗糖对肺炎克雷伯菌 MrkA 产生的调控。此外，研究还发现蔗糖不影响mrkH的转录。
5. ScrA 的同源 EIIAs 包括但不限于 Crr：研究人员观察 Δcrr突变体在 M9 - 蔗糖培养基中的生长曲线和蔗糖发酵情况，发现 Crr 在肺炎克雷伯菌摄取蔗糖过程中起重要作用，尤其在指数生长期，它很可能是 ScrA 的主要同源 EIIA，但也可能存在其他次要 EIIA 补偿其功能。研究还发现，Δcrr突变体的生物膜形成量较 WT 减少，补充crr基因可恢复表型，但在含 1% 蔗糖的 LB 培养基中，WT 和 Δcrr突变体的生物膜无显著差异，说明在蔗糖存在时，Crr 不调节生物膜形成和 Ⅲ 型菌毛的产生。
6. 蔗糖通过 ScrA 调节 crp 转录水平：已知 Crr 可调节腺苷酸环化酶（AC）活性，进而影响细胞内 cAMP 水平，而 Crp - cAMP 复合物可调节crp基因转录。研究人员通过 RT - qPCR 检测发现，蔗糖可降低 WT 菌株中crp转录本含量，但在 ΔscrA突变体中，蔗糖对crp转录的影响消失，表明蔗糖通过 ScrA 降低crp表达。
7. 蔗糖控制荚膜基因 galF：galF基因负责肺炎克雷伯菌荚膜多糖（CPS）的转运和表面组装，且受 CRP 负调控。研究人员通过 RT - qPCR 检测发现，蔗糖可提高 WT 菌株中galF转录水平，但在 ΔscrA突变体中无此作用，推测蔗糖通过 ScrA 增加肺炎克雷伯菌荚膜。

研究结论与讨论

以往研究表明，1% 蔗糖对不同细菌生物膜形成影响各异，而本研究发现其可减少肺炎克雷伯菌生物膜形成，且不影响细菌数量，这体现了细菌对蔗糖反应的多样性。研究证实 ScrA 在蔗糖调节肺炎克雷伯菌生物膜形成中起关键作用，它不仅参与蔗糖摄取，还负调控 Ⅲ 型菌毛的主要结构蛋白 MrkA，进而减少细菌附着和生物膜形成。同时，蔗糖还通过 ScrA 减少线虫肠道内肺炎克雷伯菌数量。

研究人员提出了一个模型来解释蔗糖减少肺炎克雷伯菌生物膜形成的机制。在这个模型中，Crr 作为 ScrA 和mrkA之间的中介发挥作用。在无蔗糖环境下，Crr 的磷酸化激活 AC 产生 cAMP，cAMP 与 CRP 结合形成复合物，激活mrkA转录，促进 Ⅲ 型菌毛产生和生物膜形成；而在含 1% 蔗糖环境下，蔗糖经 ScrA 转运和磷酸化，使 Crr 的磷酸基团转移，抑制了上述激活过程，从而减少生物膜形成。

此外，Crr 还参与葡萄糖摄取，且研究发现 1% 葡萄糖可抑制肺炎克雷伯菌 Ⅲ 型菌毛和生物膜形成，推测 Crr 在蔗糖缺乏和葡萄糖缺乏环境中的作用相似，均促进 Ⅲ 型菌毛合成。由于肺炎克雷伯菌常存在于食物中，而蔗糖在肠道可被分解为葡萄糖和果糖，因此推测在富含蔗糖或葡萄糖的肠道环境中，肺炎克雷伯菌会减少 Ⅲ 型菌毛和生物膜形成。虽然目前尚不清楚这种现象对肺炎克雷伯菌的具体益处，但推测这有助于细菌在丰富环境中从旧生态位转移到新生态位，避免与其他细菌竞争有限空间。

综上所述，该研究揭示了蔗糖影响肺炎克雷伯菌生物膜形成的新机制，为理解细菌与糖类的相互作用提供了新视角，也为防控肺炎克雷伯菌相关感染提供了潜在的理论依据和新的研究方向。