Cellulophaga algicola 藻酸盐裂解酶和 Pseudomonas aeruginosa Psl 糖苷水解酶抑制 Pseudomonas aeruginosa CF2843 在肺上皮细胞三维聚集体上生物膜形成》：攻克囊性纤维化难题的关键发现

为解决囊性纤维化患者肺部 Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）生物膜感染难题，研究人员开展其生物膜抑制研究。结果发现 Cellulophaga algicola 藻酸盐裂解酶（CaAly）和 Pseudomonas aeruginosa Psl 糖苷水解酶（PslG）能抑制生物膜形成，为治疗提供新方向。

　　

囊性纤维化（Cystic Fibrosis）是一种常染色体隐性遗传疾病，由囊性纤维化跨膜传导调节因子基因（CFTR）突变引发，在全球范围内广泛存在，是常见的多器官遗传性疾病。该疾病会致使肺部等器官出现厚厚的黏液层，为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等机会性细菌营造了良好的生存环境，进而引发组织损伤和器官功能丧失。其中，铜绿假单胞菌在约 80% 的囊性纤维化患者体内都能被检测到，它能形成生物膜，这种生物膜由多糖、蛋白质和 DNA 组成，对抗生素和宿主免疫因子具有很强的抗性，给治疗带来极大困难。

目前针对铜绿假单胞菌生物膜感染的治疗手段有限，传统抗生素效果不佳。而靶向生物膜基质的抗菌和酶学方法展现出了潜在的应用前景，例如藻酸盐裂解酶（Alginate lyases）、PslG 和 PelA 等相关酶，已有研究探索了它们在抑制铜绿假单胞菌生物膜形成方面的作用，但大多是在塑料表面进行的实验，缺乏在更接近囊性纤维化肺部环境模型中的研究。此前的研究多采用二维单层细胞培养模型，然而这种模型无法完全模拟体内肺组织的结构和细胞间的相互作用，不能准确反映体内的真实情况。因此，为了更好地探索这些酶在治疗囊性纤维化患者肺部感染中的作用，开展更具针对性的研究迫在眉睫。

为了解决这些问题，来自国内的研究人员开展了一项重要研究。他们利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的铜绿假单胞菌临床菌株 CF2843，结合三维（3D）肺上皮细胞培养系统，评估了碳水化合物活性酶 CaAly、PslG 和 PelAh 对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制活性。研究结果表明，CaAly 和 PslG 能够有效抑制铜绿假单胞菌 CF2843 在 A549 肺上皮细胞三维聚集体上的生物膜形成，而 PelAh 则没有明显的抑制作用。这一发现为治疗囊性纤维化患者肺部铜绿假单胞菌感染提供了新的潜在治疗策略，具有重要的临床意义。该研究成果发表在《Biofilm》杂志上。

研究人员在开展这项研究时，主要运用了以下几种关键技术方法：一是通过转座子介导的整合技术将 gfp 基因插入铜绿假单胞菌 CF2843 基因组，以便后续成像观察；二是进行全基因组分析，包括 DNA 提取、文库制备、测序和注释等，以探究菌株的基因组特征；三是采用免疫荧光和共聚焦显微镜技术，对细胞表面特征、生物膜形成情况等进行观察和分析；四是利用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）对细菌形态和生物膜结构进行表征。

下面详细介绍研究结果：

1. 转座子介导的 gfp 基因整合：研究人员成功将 gfp 基因整合到铜绿假单胞菌 CF2843 基因组中，获得了 CF2843GFP 菌株。经过多次传代培养，CF2843GFP 的 GFP 荧光强度稳定，表明 gfp 基因已稳定整合到基因组中。同时，通过 SEM 和 TEM 分析发现，CF2843GFP 与原始菌株在细胞形态上没有明显差异，并且通过基因组测序确认了 gfp 基因的插入位点。
2. CF2843GFP 的基因组特征和比较基因组学分析：CF2843GFP 的基因组测序结果显示，其基因组大小为 6,350,848 bp，GC 含量为 66.46%，编码密度为 90.3%，包含 5792 个编码序列（CDS）。通过系统发育分析发现，CF2843GFP 与 P. aeruginosa DSM 50071 关系最为密切，且与来自囊性纤维化患者的菌株 PALA56 - 22839 亲缘关系较近。此外，研究人员还对 CF2843GFP 的抗菌耐药（AMR）基因和生物膜形成相关基因进行了分析，发现该菌株含有多种耐药基因，并且生物膜形成相关基因在囊性纤维化患者分离株中更为常见。
3. A549 单层细胞和三维细胞聚集体的表型表面特征比较：研究人员分别培养了 A549 单层细胞和三维细胞聚集体，通过 SEM 和免疫荧光染色等技术对其进行分析。结果发现，三维细胞聚集体具有更复杂的结构，细胞表面的岩藻糖基化和唾液酸化程度更高，并且具有更多的紧密连接和细胞表面黏蛋白，这些特征使其更接近体内肺组织的环境。
4. CaAly、PslG 和 PelAh 对铜绿假单胞菌 CF2843GFP 生物膜形成的影响：研究人员通过共聚焦显微镜和活菌计数等方法，评估了 CaAly、PslG 和 PelAh 对铜绿假单胞菌 CF2843GFP 在 A549 单层细胞和三维细胞聚集体上生物膜形成的影响。结果显示，CaAly 和 PslG 能够显著抑制生物膜的形成，使与细胞相关的 CF2843GFP 的 GFP 荧光消失，活菌计数大幅减少；而 PelAh 则对生物膜形成没有明显的抑制作用。

在研究结论和讨论部分，研究人员指出，铜绿假单胞菌生物膜感染是囊性纤维化患者面临的严重问题，而 CaAly 和 PslG 在抑制铜绿假单胞菌 CF2843 生物膜形成方面表现出了良好的效果，这为治疗囊性纤维化患者肺部感染提供了新的潜在治疗方法。虽然此前已有研究探索了相关酶对生物膜形成的抑制作用，但大多是在体外塑料表面或动物模型中进行的，本研究在更接近体内环境的三维细胞培养模型中进行，具有重要的意义。然而，研究也存在一定的局限性，例如未对成熟生物膜的根除效果进行研究，且未对 PelAh 未发挥抑制作用的原因进行深入探究。未来的研究可以进一步探讨这些酶在根除成熟生物膜方面的效果，以及在相关动物模型中的应用，为临床治疗提供更有力的支持。总之，这项研究为囊性纤维化患者肺部铜绿假单胞菌感染的治疗开辟了新的思路，有望为改善患者的治疗效果带来新的突破。