新一代测序技术在活疫苗基质中外源因子检测中的验证与应用研究

为解决传统活疫苗外源病毒检测中动物实验的伦理和技术局限，AstraZeneca与MilliporeSigma合作开展基于NGS（新一代测序）的替代方法验证研究。通过模块化验证和基质特异性实验，证实NGS对6种模型病毒的检测限达103-104 VGC/mL，灵敏度优于传统体内（In vivo）方法，且符合ICH Q5A(R2)和欧洲药典标准。该研究为疫苗安全评估提供了高通量、高灵敏度的标准化解决方案，推动3R原则（替代、减少、优化）在生物制品领域的实践。

　　

疫苗生产中的外源病毒检测一直是生物制品安全的核心挑战。传统方法依赖动物实验（如乳鼠、鸡胚），存在伦理争议、操作繁琐且灵敏度不稳定。更棘手的是，活减毒流感疫苗（Live Attenuated Influenza Vaccine, LAIV）的卵基质可能干扰动物模型，而中和抗血清的制备又成本高昂。随着ICH Q5A(R2)指南和欧洲药典2.6.41章节的更新，新一代测序（Next Generation Sequencing, NGS）技术因其非靶向、高通量的优势，成为替代传统检测的热门候选。

AstraZeneca与MilliporeSigma的研究团队在《Biologicals》发表论文，系统验证了NGS在LAIV外源病毒检测中的应用。研究采用模块化验证策略，涵盖核酸提取、文库制备、Illumina测序和生物信息学分析四大步骤，并针对四种流感毒株（H1N1/H3N2/B Yamagata/B Victoria）基质进行特异性验证。通过WHO/FDA标准病毒面板（包括EBV、PCV、RSV等）的梯度稀释实验，证实NGS对多数病毒的检测限低至10³ VGC/mL，其中EBV和BVDV的灵敏度相当于29.73和8.86 TCID₅₀/mL。

关键实验方法
研究采用QIAGEN核酸提取试剂盒和Illumina Nextera XT建库技术，通过Agilent 2100 Bioanalyzer评估DNA质量。测序使用NextSeq2000平台（P2/P3化学试剂），数据经专有算法比对至RVDB和NCBI病毒数据库，阳性判定标准为≥100bp片段、90%同源性和病毒特异性。

研究结果

1. 基质特异性验证：在10⁴ VGC/mL浓度下，所有病毒在8次重复中检出率≥87.5%（仅REO为7/8），而10³ VGC/mL时EBV/RSV/FLV仍保持100%检出率。
2. 背景序列分析：未加标样本中检测到禽内源性逆转录病毒（如ALVE），经确认属于SPF蛋基因组固有序列，非外源污染。
3. 技术风险：NGS可能漏检低拷贝病毒或无法判断序列感染性，需结合体外（In vitro）检测等其他质控手段互补。

讨论与意义
该研究首次在LAIV体系中系统验证NGS的检测性能，其灵敏度与传统方法相当甚至更优。例如，PCV在10⁴ VGC/mL浓度下检出率100%，而传统方法曾漏检商业疫苗中的PCV污染。尽管NGS无法直接证明病毒活性，但其通过多模块系统适用性控制（如文库长度250-1,500bp、产量≥0.25 nM）确保数据可靠性。这一技术突破不仅减少90%的动物使用（符合EU 2010/63指令），更为复杂生物制品的全基因组安全评估树立新标准。未来，随着长读长测序技术的发展，NGS有望进一步解析病毒序列的完整性和功能状态，推动疫苗质控进入数字化时代。