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为解决牛结核菌素批次效价检测中动物实验的弊端，研究人员开展了 “Mass spectrometry analysis of bovine tuberculins - 3R potential in batch potency testing” 的研究。结果表明 LC-MSE可分析 PPD 结核菌素浓缩物，未来有望发展为定量 MS 方法用于批次分析。
在动物健康领域，结核病一直是困扰全球的重要问题，尤其是牛结核病，作为一种人畜共患疾病，严重威胁着畜牧业的发展和人类健康。目前，用于牛结核病体内诊断的关键工具是结核菌素纯化蛋白衍生物（tuberculin PPDs），它通过检测个体对结核杆菌的迟发型超敏反应来判断是否感染结核病。然而，现有的牛 PPD 结核菌素批次效价检测方法却存在诸多问题。
按照欧洲药典规定，当前的检测程序需要先对至少 8 只豚鼠用活的、有毒力的结核杆菌进行致敏，在动物致敏至少四周后，剃去豚鼠侧腹的毛发，皮内注射已知效价的参考制剂和待评估的结核菌素的不同稀释液，通过测量病变直径并与参考制剂比较诱导反应来计算效价。这种方法不仅实验周期长、操作繁琐，而且存在明显的缺陷。一方面，实验结果的可重复性较差，不同批次实验之间的差异较大；另一方面，实验过程会给实验动物带来极大的痛苦，引发疼痛性炎症，有时甚至会出现坏死性病变，这与动物保护的理念相悖。
为了寻找更科学、更人道的检测方法，来自国外的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们致力于探索液相色谱 - 质谱联用技术（LC-MSE）在牛结核菌素批次效价检测中的应用潜力，相关研究成果发表在《Biologicals》杂志上。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是样本处理技术，他们获取了 6 批来自 3 个不同欧洲制造商的牛结核菌素浓缩物以及世界卫生组织（WHO）的牛结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis）结核菌素 PPD 国际标准品，对样本进行透析、蛋白质浓度测定等预处理。接着，使用胰蛋白酶对样本进行消化。最重要的是，采用 nano - UPLC ESI Q - TOF - MS 进行 LC-MSE分析，并通过 ProteinLynx Global Server（PLGS） 2.4 版本对 MSE数据进行处理，在 UniProt 数据库中进行搜索以鉴定蛋白质。
研究结果令人瞩目。
- 质谱可重复性鉴定结核菌素相关蛋白：研究人员共检测到 35 种蛋白质，尽管并非每个样本都包含全部 35 种蛋白质，但这些蛋白质涵盖了广泛的亚细胞定位、生物学功能和理化性质。其中，有 8 种蛋白质（免疫原性蛋白 mpt63、热休克蛋白 HSPX、酰基载体蛋白、缺氧反应蛋白 1、主要分泌免疫原性蛋白 MPB70、10kDa 伴侣蛋白、培养滤液蛋白 10（CFP10）和 6kDa 早期分泌抗原靶（ESAT - 6））在所有样本的所有批次中均能稳定检测到。此外，通过对信号强度的观察发现，不同来源样本中丰度较高的蛋白质存在差异。
- 不同结核菌素间存在明显差异：不同来源的结核菌素中鉴定出的蛋白质数量不同，S1 来源的批次中蛋白质数量最少，S4 来源的批次中蛋白质数量最多。通过对应分析发现，S1、S2、S3 来源的结核菌素与 S4 来源的结核菌素在蛋白质检测频率上存在显著差异，分别有 10 种和 18 种蛋白质更具各自来源的特征。
- 同一制造商的结核菌素批次间存在特异性差异：在对同一制造商不同批次的结核菌素比较中发现，蛋白质检测数量在不同批次间变化明显。例如，S1 来源的两个批次以及 S4 来源的三个批次中，检测到的蛋白质数量均有所不同，且存在部分批次特异性的蛋白质差异。
综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。研究人员成功证明了 LC-MSE方法可作为牛结核菌素一致性检测的有效工具。研究鉴定出的 35 种候选蛋白，尤其是始终存在的 8 种蛋白质，可作为批次一致性检测的可靠替代标志物，不仅能反映产品生产过程中的一致性，还与产品的诊断质量密切相关。此外，该研究为进一步将此方法发展为定量、全面表征的 LC-MS 检测形式奠定了基础，未来有望实现通过体外检测间接评估结核菌素 PPD 批次效价，减少对动物实验的依赖，推动牛结核菌素检测技术向更科学、更人道的方向发展。
