进化工程与诱变技术协同提升Spathaspora passalidarum在甘蔗渣酸解液中的乙醇转化效率

本研究针对甘蔗渣酸解液(HH)中抑制物阻碍酵母发酵的行业难题，通过进化工程(EE)结合紫外(UV)和甲磺酸乙酯(EMS)诱变技术，成功获得三株性能提升的Spathaspora passalidarum突变株。其中JY5102EMS菌株的乙醇得率(YEtOH)达0.42 g/g，较原始菌株提升1.5倍，且木糖醇产量(YXylitol)降低60%，为第二代乙醇(2G乙醇)生产的菌种改良提供了创新方案。

　　

随着全球能源需求增长，利用木质纤维素生产第二代乙醇(2G乙醇)成为替代化石燃料的重要途径。甘蔗渣作为巴西主要农业废弃物，其酸解产生的半纤维素水解液(HH)富含木糖，但伴随产生的乙酸、糠醛等抑制物严重阻碍酵母发酵效率。尽管天然木糖发酵酵母Spathaspora passalidarum因具有双基因编码的木糖还原酶(SpXYL1.1/SpXYL1.2)和NADH偏好性而展现出优越的木糖转化能力，但其对HH中抑制物的敏感性制约了工业应用。

针对这一瓶颈，研究人员开展了一项创新性研究。通过系统评估乙酸(AA)、糠醛等单一抑制物对酵母生长的影响，发现1.5 g/L乙酸即可完全抑制菌株生长。基于此，研究团队设计了三阶段进化工程策略：首先在含10% HH的YPX培养基中连续传代，随后梯度增加HH浓度至50%，最终在含2 g/L乙酸的筛选压力下获得适应株JY5102。为进一步提升性能，分别采用紫外(UV)和甲磺酸乙酯(EMS)诱变处理JY5102，获得JY5102UV和JY5102EMS突变株。

关键技术包括：1）多阶段进化工程结合化学/物理诱变；2）基于生长动力学参数（最大比生长速率μ_max和延滞期λ）的抑制物耐受性评价；3）使用巴西国家生物质能实验室提供的甘蔗渣HH进行发酵验证。

研究结果显示：
抵抗测试与协同抑制
通过测定μ_max和λ证实，乙酸是影响S. passalidarum生长的最关键抑制物，2 g/L浓度下λ延长至58小时。协同抑制实验显示，复合抑制物的毒性效应呈加和性而非协同性。

突变株性能突破
JY5102UV和JY5102EMS在HH发酵中表现突出：

• 乙醇得率(Y_EtOH)分别达0.39和0.42 g/g，较原始菌株提升1.6倍和1.5倍
• 木糖醇得率(Y_Xylitol)显著降低30%和60%
• 发酵时间缩短至72小时内完成

代谢机制解析
突变株性能提升可能与木糖醇代谢通路优化相关。双基因编码的木糖还原酶(SpXYL1.2)的NADH偏好性促进氧化还原平衡，减少副产物积累。EMS诱变可能进一步强化了木糖醇脱氢酶(XDH)活性，使碳流向乙醇合成途径倾斜。

这项研究首次将进化工程与化学/物理诱变技术联用，成功构建出能高效转化HH的S. passalidarum工业菌株。其重要意义在于：1）证实组合育种策略对非模式酵母的适用性；2）为木质纤维素生物炼制提供了耐受抑制物且乙醇得率提升的候选菌株；3）揭示了NADH依赖型木糖还原酶在维持氧化还原平衡中的关键作用。该成果发表于《Biomass and Bioenergy》，为推进2G乙醇产业化提供了切实可行的菌种改良方案。