活细胞中钙离子激活触发的SNARE复合体动态组装与解聚机制研究

为解决SNARE复合体在囊泡分泌过程中动态变化的机制争议，研究人员通过构建SNAP25基FRET探针SCORE，结合全细胞膜片钳脉冲刺激和TIRF成像技术，证实钙电流激活诱导的FRET瞬变反映SNARE复合体的组装与解聚过程，而非分子扩散效应。该研究发表于《Biophysical Journal》，为突触传递的分子调控提供直接证据。

　　

神经递质释放是大脑信息传递的核心过程，这一精密机制依赖于SNARE（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）复合体的动态组装与解聚。尽管已知钙离子(Ca²⁺)内流触发囊泡与质膜融合，但SNARE复合体在分泌过程中的实时动态变化仍存在关键争议：早期研究观察到囊泡分泌位点出现的短暂FRET（荧光共振能量转移）信号增强，究竟源于SNARE复合体的解聚，还是探针分子的扩散重组？这一问题直接关系到对突触可塑性和神经递质释放调控机制的理解。

为破解这一难题，研究人员开发了基于SNAP25的FRET探针SCORE（SNARE COmplex REporter），通过全细胞膜片钳技术精确控制钙电流激活，结合全细胞足迹的TIRF（全内反射荧光）成像，排除了分子扩散对FRET信号的干扰。实验发现，钙脉冲刺激诱导的FRET比率瞬变与囊泡分泌事件具有相似动力学特征，且该现象在Synaptobrevin 2/Cellubrevin双敲除的胚胎嗜铬细胞中完全消失。通过建立扩散动力学模型与实验数据对比，首次证实FRET信号变化直接反映SNARE复合体的组装-解聚循环，而非分子位置重组。该成果发表于《Biophysical Journal》，为突触传递的分子调控机制提供了时空分辨率达毫秒级的直接证据。

关键技术方法包括：1）构建SNAP25基FRET探针SCORE监测SNARE复合体动态；2）全细胞膜片钳脉冲刺激精确控制钙电流；3）TIRF成像实现高时空分辨率活细胞观测；4）使用Synaptobrevin 2/Cellubrevin双敲除小鼠胚胎嗜铬细胞验证特异性；5）建立扩散动力学模型区分分子扩散与复合体解聚效应。

【SCORE探针揭示SNARE复合体动态】
通过SCORE探针观察到分泌位点出现<0.5 μm²的局部FRET增强，该信号在囊泡融合前数十毫秒出现并持续数秒，与囊泡priming阶段相关。全细胞TIRF成像显示，钙脉冲刺激可诱导全细胞范围的FRET比率瞬变，其动力学特征与局部信号高度一致。

【扩散效应排除实验】
建立理论扩散模型模拟显示，分子扩散导致的FRET信号衰减时程（约20秒）远慢于实验观测值（数秒）。在固定细胞中进行的对照实验进一步证实，FRET衰减不受分子运动影响。

【vSNARE依赖性验证】
在缺乏囊泡SNARE蛋白（vSNARE）Synaptobrevin 2/Cellubrevin的细胞中，钙脉冲完全不能诱导FRET变化，证明SCORE必须通过vSNARE介导才能参与SNARE复合体组装。

研究结论明确指出，钙电流激活触发SNARE复合体的快速组装，随后通过ATP非依赖性的自发解聚完成循环。这一发现革新了对囊泡分泌分子机器的认知：SNARE复合体并非仅在融合时一次性使用，而是在priming阶段就经历动态重组。该机制为理解突触可塑性、神经退行性疾病中分泌异常提供了新视角，同时建立的SCORE技术平台为研究其他膜融合过程开辟了新途径。讨论部分强调，该研究首次在活细胞中捕捉到SNARE复合体的完整工作循环，其毫秒级动态解析能力为后续研究神经递质释放的精确调控奠定了方法学基础。