基于ACDAN荧光光谱相量分析的蛋白质构象动态监测：从解折叠到相分离的微环境解析

本研究针对蛋白质动态转变过程中微环境变化的监测难题，利用ACDAN荧光探针结合光谱相量分析技术，系统探究了蛋白质解折叠、淀粉样聚集(amyloid aggregation)和液-液相分离(LLPS)过程中的关键分子事件。研究发现ACDAN可灵敏检测Thioflavin-T无法识别的早期聚集态溶剂偶极弛豫事件，并首次绘制了蛋白质生物凝聚体的物理化学微环境图谱，为理解蛋白质相变机制提供了创新工具。该技术兼容常规荧光光谱仪和显微镜平台，具有重要应用价值。

　　

在生命科学领域，蛋白质的动态行为犹如分子世界的"变形记"——从规整的折叠状态到松散的解构形态，从有序的纤维聚集到无序的液相分离，这些转变过程与神经退行性疾病、癌症等重大疾病密切相关。然而，传统研究手段如Thioflavin-T染色仅能捕获淀粉样纤维形成的终末阶段，对早期分子事件和微环境变化的探测始终是技术瓶颈。更棘手的是，近年来备受关注的液-液相分离现象中，蛋白质凝聚体内部的物理化学异质性仍缺乏有效表征方法。这些认知空白严重制约着对蛋白质病理性相变机制的深入理解。

针对这些挑战，发表在《Biophysical Reports》的研究团队创新性地将ACDAN（6-丙酰基-2-二甲氨基萘）荧光探针与光谱相量分析技术相结合，构建了一个多维度的蛋白质动态监测平台。这项研究的技术核心在于：首先采用稳态荧光光谱和时域荧光寿命成像（FLIM）获取ACDAN的全光谱特征；其次通过相量变换将复杂光谱数据转换为直观的二维坐标；最后结合超分辨率显微镜对蛋白质凝聚体进行空间微区分析。研究队列包括体外纯化的模型蛋白质体系以及细胞内的内源性蛋白凝聚体。

在"蛋白质解折叠过程的早期检测"部分，研究证实ACDAN的发射光谱蓝移现象能比圆二色谱早30分钟检测到α-螺旋结构的松动，其相量轨迹呈现独特的"S"形转变路径。特别值得注意的是，在尿素诱导的逐步变性实验中，相量分析首次揭示了蛋白质核心疏水区域在完全解折叠前就发生的预熔化（pre-melting）事件，这一发现为理解蛋白质稳定性阈值提供了新视角。

关于"淀粉样聚集的偶极弛豫特征"，研究发现ACDAN能捕捉到Thioflavin-T阴性阶段的溶剂重组信号：在β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集初期，相量图中出现短暂的红点聚集区，对应着水分子在蛋白表面形成的介电屏蔽层（dielectric screening layer）。这种特征性的"红移-蓝移"振荡模式被证实是纤维核形成的预测指标，其灵敏度比传统方法提高两个数量级。

在"生物凝聚体的微环境异质性"章节，研究团队通过偏振分辨相量成像技术，在FUS蛋白液滴中识别出三种不同的微区：高极性表面区（相量角120°）、低粘度核心区（相量半径<0.3）以及过渡区的偶极-偶极耦合域。这些物理参数的定量分布为解释生物分子凝聚体的功能分区现象提供了直接证据。

结论部分强调，该研究建立的ACDAN-相量分析平台突破了传统荧光探针的局限性，实现了对蛋白质动态过程的多尺度解析：在时间维度上可追踪毫秒级的微环境波动，在空间尺度上能达到200 nm的分辨率。特别值得关注的是发现偶极弛豫事件（dipolar relaxation）在各类蛋白质相变中均扮演"分子开关"角色，这为开发靶向相变界面（phase boundary）的新型调控策略奠定了方法学基础。该技术体系已成功应用于亨廷顿病相关蛋白的聚集早期诊断，相关转化研究正在推进中。