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本文全面综述了微生物酰胺酶（EC 3.5.1.4）。介绍其分布、分类和特性，如底物特异性、稳定性等。阐述基因挖掘、蛋白工程等技术对其性能的提升，以及在有机合成、生物降解等领域的应用，展现了其在生物技术领域的巨大潜力。
1. 引言
酰胺酶（Amidase 或 amidohydrolase，EC 3.5.1.4）属于水解酶家族，能水解非肽酰胺键（–CO–NH-）生成相应的羧酸，还具有酰基转移酶活性，可利用羟胺作为共底物生成异羟肟酸。因其对映体和立体选择性等特性，在学术界和工业界备受关注，在商品化学合成、制药、农业化学以及环境污染物解毒等方面有重要作用。例如，酰胺酶催化生成的丙烯酸，预计到 2032 年市场价值将超 220 亿美元。
微生物是获取酰胺酶的理想来源，相较于动植物等其他来源，微生物具有易于生产、便于基因改造等优势。酰胺酶主要分为酰胺酶特征家族（Amidase signature family）和腈水解酶超家族（nitrilase superfamily）。前者具有特征序列 GGSS (S/G) GS 和高度保守的 Ser-Ser-Lys 催化残基，底物谱较广；后者具有 Glu-Lys-Cys 催化残基，对小脂肪族底物有活性 。
近年来，利用先进技术增强酰胺酶性能成为研究热点。蛋白工程技术如定点突变、定向进化等可提高其催化效率、结构稳定性和底物选择性等。同时，酰胺酶在降解杀虫剂、农药、聚氨酯和食品中的酰胺等方面的作用逐渐被发现，其应用领域不断拓展。
2. 分布和生产
酰胺酶在自然界分布广泛，存在于动物、植物、细菌、真菌和放线菌等多种物种中。微生物来源的酰胺酶因数量丰富、易于生产和基因操作，成为研究和应用的重点。常见产酰胺酶的细菌属有Alcaligenes、Arthrobacter、Bacillus等；真菌中，Aspergillus nidulans可产生四种脂肪族酰胺酶，Aspergillus candidus是较好的乙酰胺酶产生菌；在古细菌如Methanococcus jannaschi、Archaeoglobus fulgidus和Pyrococcus horikoshi中也有酰胺酶的研究报道。
产酰胺酶的微生物生活在不同温度和 pH 的环境中。中温菌如Alcaligenes sp. MTCC 10674 和Rhodococcus sp. N-771 在 20 - 37°C 产生酰胺酶；嗜热菌如Geobacillus pallidus BTP-5x 在 40°C 以上产酶，Pyrococcus yayanosii CH1 甚至能在高达 108°C 产酶。多数微生物产酰胺酶的最适 pH 接近中性，但也有例外，如Rhodococcus rhodochrous NHB-2 和Kluyveromyces thermotolerans MGBY 37 的最适 pH 分别为 5.5 - 6.0 和 6.2 。
根据氨基酸序列、系统发育关系和催化特性，酰胺酶可分为腈水解酶超家族和酰胺酶特征（AS）家族。腈水解酶超家族酰胺酶催化酰胺中 C - N 键的裂解，偏好短链脂肪族酰胺，具有 Cys-Lys-Glu 催化三联体。AS 家族酰胺酶含有约 130 个富含丝氨酸 - 甘氨酸的保守氨基酸序列和 Ser-Ser-Lys 催化三联体，通常底物谱较广，能水解芳香族酰胺和脂肪族酰胺等 。
基因挖掘策略为酰胺酶的生物技术应用提供了新途径。新一代测序（NGS）方法如单细胞测序和全基因组鸟枪法宏基因组测序，有助于发现新的酰胺酶。但宏基因组方法存在构建文库耗时、资源昂贵等问题。近年来，基因组挖掘方法已成功从多种微生物中发现具有潜在应用价值的酰胺酶，如Brevibacterium epidermidis ZJB-07021、Delftia tsuruhatensis ZJB-05174 和Parvibaculum lavamentivorans ZJB14001 等 。
3. 生物物理和分子特性
3.1. 纯化
纯化可提高酰胺酶的功效、稳定性和保质期，去除杂质。常用的纯化技术包括硫酸铵分级分离、透析、超滤以及多种色谱方法（离子交换、尺寸排阻、疏水相互作用、亲和和羟基磷灰石色谱）。传统纯化方法可能存在挑战，如操作繁琐、产率低等。新型纯化技术如热处理细胞无细胞提取物、利用 Ni-NTA 亲和色谱进行重组表达和单步纯化等，可提高总酶产量，减少下游处理步骤 。
纯化后的酰胺酶有单体和多聚体形式，由同源或异源亚基组成。文献报道的酰胺酶纯化倍数在 3.2 - 328.9 之间，总产率在 1.49 - 53.20% 之间。从野生生物中提取的酶纯化难度较大，因其产量低、组成复杂且常含污染物，需要更复杂的纯化技术和定制策略 。
3.2. 温度和 pH 稳定性
酰胺酶在工业应用中常受限于其在多种反应介质中的稳定性。对嗜热微生物中酰胺酶的热稳定性研究表明，不同来源的嗜热微生物酰胺酶具有不同的动力学稳定性（半衰期，t1/2）。例如，Sulfolobus solfataricus的酰胺酶在 80°C 和 90°C 的半衰期分别为 25 h 和 0.5 h；Pseudonocardia thermophila的酰胺酶在 70°C 的半衰期为 72 min 。
酰胺酶的活性通常局限于较窄的 pH 范围，但也有研究报道部分酰胺酶在较宽 pH 范围内有活性。了解酰胺酶的 pH 和温度稳定性，对选择合适的酶用于特定工业应用和优化酶生产过程至关重要。
3.3. 底物特异性
酰胺酶是多功能生物催化剂，具有广泛的底物特异性、亲和力和对映选择性。它能水解多种酰胺，包括脂肪族、芳香族、杂环以及 α - 氨基和 α - 羟基酰胺，还具有酰基转移酶活性，可在羟胺存在下合成异羟肟酸 。
近年来，酰胺酶在对映选择性合成重要医药中间体方面的研究受到关注。例如，用于合成抗癫痫药物普瑞巴林的手性中间体、水解内消旋吡咯烷 - 2,5 - 二羧酸酰胺生成 4 - 氨甲酰基吡咯烷 - 3 - 羧酸衍生物以及内消旋 O - 杂环二羧酸酰胺的去对称化等反应 。大多数对映选择性酰胺酶对 S - 特异性对映体表现出选择性，少数偏好 R - 对映体。
酰胺酶的水解和酰基转移酶活性取决于可用底物。其反应机制先是作用于底物含酰胺基的碳原子形成中间状态，释放氨作为第一个产物，然后酶 - 酰基中间状态将酰基转移到水、羟胺或肼上，分别生成羧酸、异羟肟酸或酸肼 。
3.4. 结构分析
酶的晶体结构对于理解和验证其活性、特异性和稳定性至关重要。通过对细菌酰胺酶晶体结构的研究发现，不同来源的酰胺酶结构存在差异。例如，S. maltophiliai的肽酰胺酶是一种紧凑的单结构域蛋白，含有酰胺酶特征序列和催化残基 Ser226、Ser202 和 Lys123 。
Pseudomonas aeruginosa的脂肪族酰胺酶属于腈水解酶家族，由六个 38-kDa 大小的单体组成，每个单体是一个四层 αββα 三明治结构。其催化三联体 Glu-Lys-Cys 位于漏斗形 13 ? 深口袋的底部，Cys 残基作为亲核试剂，对底物羰基进行亲核攻击，在酰基转移活性和酰胺酶特异性中起重要作用 。
Rhodococcus sp. N-771 的酰胺酶（RhAmidase）重组天然形式为约 107 kDa 的二聚体，每个单体包含三个结构域。其活性位点由大结构域和小结构域的多个残基组成，关键残基 Ser、Ser195和 Lys 对底物水解至关重要 。
腈水解酶超家族的酰胺酶具有保守的催化三联体 Cys、Glu、Lys，负责共价和酸碱催化。AS 家族的酰胺酶则具有 Cys、Ser、Lys 或 Ser、Lys 等催化残基，其中 Ser 作为催化亲核试剂，Lys 作为酸碱催化剂 。
4. 增强酰胺酶活性的进展
4.1. 重组酰胺酶
大多数微生物与基本的工业发酵过程存在兼容性问题，天然嗜热酶产量低也限制了大规模生产。因此，过去几十年研究重点转向嗜热酶的重组生产。多种嗜热酰胺酶已在Escherichia coli等细菌宿主中克隆和过量表达 。
E. coli因生长迅速、成本低、易于基因操作和重组蛋白的转化与分离，成为表达重组蛋白的理想平台。例如，Sulfolobus solfataricus的酰胺酶基因在E. coli BL21 中表达，所得重组酶对 2 - 苯基丙酰胺具有高对映选择性；Klebsiella oxytoca的新型热稳定立体特异性酰胺酶在E. coli K12 中表达，可合成高纯度的 (R)-3,3,3 - 三氟 - 2 - 羟基 - 2 - 甲基丙酸 。
4.2. 蛋白工程
定向进化方法是酶工程和改进的关键，包括随机诱变和定点或位点特异性诱变。近年来，研究人员对酰胺酶进行定向进化和定点突变，以研究其结构 - 功能关系，提高催化活性和特异性 。
通过定点突变研究Pseudomonas aeruginosa酰胺酶发现，关键残基 Glu59 对维持酶的天然结构和活性至关重要。对Ochrobactrum anthropi C1-38 酰胺酶进行随机诱变，其比活性提高了 2.9 倍；对Pseudomonas putida酰胺酶进行突变，可增加其对 (S)- 扁桃酰胺和 (S)- 乳酰胺的对映选择性和改变动力学参数 。
4.3. 固定化
游离酶在恶劣条件下易变性，影响生产过程。酶和细胞的固定化可提高其可重复使用性、灵敏度、选择性、储存稳定性和操作稳定性，还能增强对底物、产物和溶剂抑制的抗性 。
常用的固定化方法有吸附、共价连接、交联、包封和包埋等。例如，固定化的Rhodococcus erythropolis 细胞可将丙烯酰胺转化为丙烯酸，且能重复使用 20 多个反应周期，残留酰胺酶活性为 50%；固定化的Rhodococcus pyridinivorans细胞产异羟肟酸的操作稳定性提高，对 pH、温度和金属离子抑制剂的耐受性增强 。
酰胺酶固定化后在生物降解方面也表现出良好性能。如固定化的Pseudomonas putida KT2440 酰胺酶可快速降解有害酰胺；交联酶聚集体（CLEAs）能完全降解工业废水中的丙烯酰胺，且在 4°C 下稳定 15 天，重复使用 3 次后仍有 40% 的残留活性 。
5. 酰胺酶的生物催化潜力
5.1. 有机合成
微生物酰胺酶在羧酸和异羟肟酸的合成中应用广泛。在学术界，报道较多的是利用酰胺酶生产丙烯酸、烟酸、异烟酸等。在工业上，酰胺酶与腈水合酶结合，可通过腈的生物转化生产重要有机酸，还能将土壤中的环境污染物乙腈降解为乙酸 。
酰胺酶的酰基转移活性可通过 Ping-Pong Bi–Bi 机制将酰基转移到羟胺上，生成异羟肟酸。传统异羟肟酸合成方法存在缺点，而利用微生物进行生物催化合成具有绿色环保的优势。异羟肟酸在生物医学领域具有多种治疗作用，如治疗心血管疾病、癌症、阿尔茨海默病等 。
微生物酰胺酶已成功用于多种治疗产品的生产，如手性氨基酸、抗癫痫药物普瑞巴林、抗疟疾药物和非甾体抗炎药等。
5.2. 生物降解
微生物酰胺酶对多种有毒有害化学物质的生物降解效率备受关注。例如，Stenotrophomonas maltophilia J2 可有效降解吡啶，其高降解率归因于编码脱氢酶和酰胺酶的基因表达增加；新型酰胺酶可高效降解含腈杀虫剂氟啶虫酰胺、啶虫脒以及氨基甲酸酯类除草剂苯胺灵等 。
此外，酰胺酶还可参与聚氨酯的降解。酯酶和酰胺酶的协同作用可实现热塑性聚氨酯的酶促回收；Aspergillus fumigatus的丙烯酰胺酰胺水解酶可降解食品中的丙烯酰胺，且不影响有益的立体化学相关化合物 。
5.3. 商业应用与生产
Lonza AG 公司利用Klebsiella oxytoca的对映特异性酰胺酶，开发了生产 (R)-3,3,3 - 三氟 - 2 - 羟基 - 2 - 甲基丙酸和 (S)-3,3,3 - 三氟 - 2 - 羟基 - 2 - 甲基丙酸的工艺，这两种酸是合成多种潜在药物的中间体 。
酰胺酶在生物催化中用于多种酰胺的化学、区域和对映选择性水解，全球对其需求的增加促使生产设施不断扩大。多家公司生产和供应酰胺酶，其应用涵盖化学、制药、生物修复等多个领域 。
6. 结论
酰胺酶因其出色的底物对映选择性和广泛的特异性，在学术界和工业界备受关注。产酰胺酶的微生物可作为生产工业重要羧酸的细胞工厂，其在废水处理和医药行业也有应用潜力。极端微生物来源的酰胺酶在非温和环境下稳定性高，拓展了其工业应用范围。
基因和蛋白质工程技术的应用提高了酰胺酶的活性和稳定性，固定化技术改善了其生物催化功能。酰胺酶在有机合成和生物降解方面的综合作用，使其生物技术潜力不断扩大。借助遗传和蛋白质工程工具，酰胺酶在有机合成和污染修复等领域的应用前景将更加广阔，有望成为有前途的绿色生物催化剂 。
